超高压协同乳酸链球菌素抑制低温火腿中的耐压腐败菌

温斯颖，韩衍青，方东路，陈 威，吴菊清，徐幸莲，*

（1.南京农业大学食品科技学院，江苏南京210095；2.南京农业大学教育部肉品加工与质量控制重点实验室，江苏南京210095）

超高压协同乳酸链球菌素抑制低温火腿中的耐压腐败菌

温斯颖1，韩衍青2，方东路1，陈 威1，吴菊清2，徐幸莲2，*

（1.南京农业大学食品科技学院，江苏南京210095；2.南京农业大学教育部肉品加工与质量控制重点实验室，江苏南京210095）

为探寻低温肉制品中耐压腐败菌的抑制手段，揭示超高压和乳酸链球菌素之间的协同抑菌效应。以肉制品中典型的耐压腐败菌绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌为供试材料，评价二者在1～500μg/mL的乳酸链球菌素存在条件下的生长情况，并结合100～600MPa（5min，20℃）的超高压处理研究不同压力条件与乳酸链球菌素之间的协同增效作用。结果表明：随着乳酸链球菌素添加量的增加，两种菌的数量急剧降低，当添加量达到200μg/mL时，对二者的抑制程度达到最大；单独超高压处理时，绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌分别在400MPa和300MPa的压力下受到显著抑制。而超高压结合200μg/mL乳酸链球菌素处理时，二者受到显著抑制的压力均降低到100MPa；500MPa，5min，20℃的超高压条件结合200μg/mL乳酸链球菌素处理能够抑制绿色魏斯菌数达9lg（cfu/mL）。超高压和乳酸链球菌素之间存在显著的协同作用，乳酸链球菌素的添加将会有效降低工业化生产中超高压的压力水平。

超高压，乳酸链球菌素，耐压菌

超高压处理（high pressure processing，HPP）能够很好地保持食品原有的色香味型[1]，是目前一项公认的具有发展前景的非热加工技术。如今超高压处理食品在日本、韩国、欧美国家均已进入工业化生产，而我国刚刚进入起步阶段，各种罐头制品、果蔬制品以及水产制品均开始了初步尝试，技术手段亟待成熟，尤其表现在压力大小的选择方面。600MPa，12℃，10min的超高压处理能够有效改善低温火腿的货架期[2]。然而600MPa以及更高的压力对超高压设备性能要求比较高，高压力一方面增加了加工成本，另一方面存在潜在的引起肉品品质指标恶化的风险，比如褪色、软化以及脂肪氧化等。食品加工过程中一般采用能够达到杀菌灭酶效果的最小压力。因此，有效降低压力水平对于推进超高压食品工业化生产有重要作用[3]。乳酸链球菌素（Nisin）是一种由乳酸乳球菌乳酸亚种合成的细菌素，是目前公认的安全高效天然食品防腐剂。徐胜等[4]发现乳酸链球菌素添加浓度在100～200μg/mL范围内，经超高压处理的火腿肠持水性、色泽无显著变化，货架期有效改善。Elaine等[5]在牛奶抑菌实验中证实，超高压和乳酸链球菌素结合能够显著提高抑菌效果。Dalgaard研究认为，大多数情况下，食品中只有特定腐败菌（specific spoilage organism，SSO）参与腐败过程[6-7]。在贮藏过程中，SSO的快速生长繁殖主导了食品的腐败过程[8]。绿色魏斯菌（Weissella viridescens）和肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）是目前证实的超高压低温肉制品中的两株典型腐败菌[9-11]，是超高压处理肉制品中主要分离到的特定腐败微生物，也是目前低温肉制品保鲜领域的焦点微生物。本研究以分离自国内低温火腿中的上述两株特定腐败菌绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌[10]为研究对象，以乳酸链球菌素和超高压作为栅栏因子，揭示二者协同处理对两种菌存活率的影响，为降低工业化生产中的压力水平，有效延长低温火腿的货架期提供理论数据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

绿色魏斯菌（Weissella viridescens）、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides） 由16S rDNA序列比对结果鉴定[10]，并通过Vitek2细菌全自动鉴定仪（法国梅里埃）确认；乳酸链球菌素 浙江银象生物工程有限公司提供；革兰氏染色液、MRS琼脂培养基、MRS肉汤培养基 均购自北京陆桥科技有限公司；0.22μm水系微孔滤膜 购自天津东康科技有限公司；125mm×334mm型耐压包装袋 购自北京华盾塑料有限公司。

超高压设备UHPF/2L/800MPa 内蒙古包头科发高新技术食品机械公司；紫外分光光度计Spectrum723 上海光谱仪器有限公司；超净工作台SW-CJ-2FD 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；真空抽滤装置 EHSY西域中国有限公司；高速冷冻离心机Allegra64R Beckman；生化培养箱SPX-250B-Z 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；立式压力蒸汽灭菌器LDZX-50KBS 上海申安医疗器械厂；连续点动微型旋涡混合仪WH-2 上海沪西分析仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 生长曲线的建立 采用比浊法[11]建立绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌的生长曲线。具体操作如下：将活化后的菌株按1%～3%的接种量无菌条件下接种到MRS肉汤培养基中，30℃下培养。每隔2h取样，吸取5mL0.85%的生理盐水对样品离心洗脱，重复三次，最后加入5mL生理盐水重悬菌液，生理盐水作空白对照，600nm波长下比色，记录光密度值（OD值），以培养时间为横坐标，菌悬液OD值为纵坐标，建立生长曲线。

1.2.2 乳酸链球菌素耐受实验 配制0.02%的柠檬酸溶液（pH3～4），以此作为溶剂配制50mg/mL的乳酸链球菌素贮存母液，使用0.22μm水系微孔滤膜过滤除菌，置4℃条件下保存备用。

配制MRS琼脂培养基，待其降至适宜温度后在无菌条件下加入乳酸链球菌素贮存母液，分别调整其浓度为0、1、100、200、300、400、500μg/mL，充分混匀。取培养至稳定期的对象菌，以灭菌的MRS肉汤培养液（pH6.0）洗脱，并调整绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌数量分别至109、108cfu/mL。按照GB/T4789.2-2008操作，以上述添加乳酸链球菌素的MRS琼脂培养基进行倾注培养，培养条件为30℃，48h，评价两种菌对乳酸链球菌素的耐受程度。

1.2.3 超高压处理 取培养至稳定期的菌体，以上述方法调整绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌数量分别至109、108cfu/mL，将二者的MRS肉汤悬浮液分装于无菌的聚酰胺/聚乙烯包装袋，每袋2mL。热封口，不留顶隙。分别采用0、100、200、300、400、500、600MPa的压力超高压处理5min，处理时间不包括升压和卸压的时间（传压介质为葵二酸二辛酯液压油）。处理时的油温为20℃，升压过程中油温会上升，约1～2℃/ 100MPa。每组处理设两个重复，处理完毕样品放入盛有冰袋的泡沫箱中运回实验室，按照GB/T4789.2-2008进行平板计数，培养条件同上。

1.2.4 超高压和乳酸链球菌素结合处理 于上述调整好绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌数量的MRS肉汤悬浮液中添加乳酸链球菌素至其终浓度为200μg/mL，混合均匀，分装，每袋2mL，包装方法同上。每组设两个重复，分别采用0、100、200、300、400、500、600MPa的压力进行超高压处理5min，以未添加乳酸链球菌素且未受超高压处理的样品作空白对照。按照GB/ T4789.2-2008进行平板计数，培养条件同上。

1.2.5 统计分析 数据统计采用SAS8.12进行ANOVA单因素方差分析及Ducan’s多重检验（Plt;0.05），数值以均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌的生长曲线

图1显示了接种后的绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌在MRS肉汤培养过程中的生长变化情况。绿色魏斯菌在接种2h后进入指数生长期，12h后生长速率开始下降，16～18h到达稳定期，此时菌体数量也达到最大，之后进入衰亡期开始下降；肠膜明串珠菌在接种4h后进入指数生长期，培养18h后进入稳定期，22h后进入衰亡期。由二者的生长曲线可见，绿色魏斯菌的延迟期相对较短，短时间内数量增加到最大。大多数的研究表明，绿色魏斯菌适应环境的能力比较强，是一种既能耐受热处理又能耐受超高压处理，同时还能耐受低浓度有机酸处理的腐败微生物[9-10，12]。依据生长曲线结果，确定绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌的稳定生长期分别为培养16～18h和培养18～22h，以下抑菌实验均使用此时间段菌株作为对象菌种。

图1 绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌的生长曲线Fig.1 Growth curves of W.viridescens and L.mesenteroides

2.2 乳酸链球菌素耐受实验

绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌对乳酸链球菌素的耐受程度见图2。随着乳酸链球菌素添加浓度的升高，绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌生长受到的抑制强度增大。肠膜明串珠菌对乳酸链球菌素的耐受性较差，200μg/mL的乳酸链球菌素能够使该菌数量降低8lg（cfu/mL）；而绿色魏斯菌的耐受性较强。当乳酸链球菌素含量上升至200μg/mL后，抑制程度不再发生显著变化，近4lg（cfu/mL）的绿色魏斯菌存活。

由于能够改变革兰氏阳性菌细胞膜的通透性而导致细胞自溶死亡[13-14]，乳酸链球菌素在食品特别是肉品中的应用非常广泛。绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌均属于革兰氏阳性菌，由图2可知，乳酸链球菌素对二者表现出较强的抑制效果，尤其是对肠膜明串珠菌。然而，绿色魏斯菌仍有近4lg（cfu/mL）的存活，说明绿色魏斯菌对乳酸链球菌素存在一定的耐受性，即使在500μg/mL的乳酸链球菌素浓度下，绿色魏斯菌仍然能够生长繁殖。

图2 不同浓度乳酸链球菌素对绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌的抑制效果Fig.2 Effect of Nisin on inhibition of W.viridescens and L.mesenteroides

2.3 超高压和乳酸链球菌素的协同抑菌效果

表1列出了单独超高压处理以及添加200μg/mL乳酸链球菌素后超高压处理的实验结果。单独超高压处理时，绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌数量随压力升高均逐渐减少。绿色魏斯菌初始数量为9.04lg（cfu/mL）；压力升高至400MPa时，开始显著减少，近4lg（cfu/mL）受到抑制；继续升高压力至500MPa和600MPa时，绿色魏斯菌均表现出显著减少的趋势，在最高压力600MPa时，绿色魏斯菌数量下降至2.35lg（cfu/mL）。肠膜明串珠菌对压力的耐受性较差，压力升高至300MPa时开始显著减少，继续升高压力至500MPa时肠膜明串珠菌被完全抑制。添加200μg/mL乳酸链球菌素后进行超高压处理时，绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌数量随压力升高而减少的幅度变大，且抑制效果并非简单的叠加，而是呈显著的协同作用。乳酸链球菌素存在时，绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌受到显著抑制的压力均降低到100MPa，二者分别在500MPa和400MPa时达到完全抑制。

表1 超高压和乳酸链球菌素结合处理绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌Table1 The change of inhibition effect after adding Nisin at high pressure processing

绿色魏斯菌是超高压肉制品中最常分离到的腐败菌之一，能够耐受600MPa甚至更高的压力。Patterson等[15]在研究鸡肉制品保藏中发现，绿色魏斯菌在600MPa，18℃，2min处理条件下细菌数量仅有不到1lg（cfu/g）的减小。Diez等[9]的研究表明，绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌是超高压处理的血肠制品中的优势腐败菌。本文的数据证实，分离自低温烟熏火腿中的绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌同样能够耐受超高压处理，单纯超高压处理无法彻底抑制绿色魏斯菌的生长。

如何有效抑制此类微生物的生长繁殖是学术界和产业界亟待解决的难题。目前报道的抑制手段主要包括超高压结合热处理[16]、有机酸[17]以及生物的或天然的抑菌成分[18-19]等。本研究采用超高压和乳酸链球菌素作为栅栏因子，结果表明二者存在明显的协同增效作用。前人的研究认为[1，20]，超高压抑制微生物生长主要通过影响微生物细胞膜和细胞功能性蛋白实现。超高压能够导致微生物细胞发生不可逆的体积减小，从而引起细胞形态发生异常，细胞膜通透性发生变化，最终导致细胞质及细胞内容物的流失（尤其在压力保持阶段），细胞死亡[21]；另一方面，细胞内大量的聚合蛋白在超高压作用下发生变性分离，微生物出现受伤或者死亡[22]。乳酸链球菌素的存在，导致细胞膜的去极化以及胞内ATP的泄露，加剧了超高压对细胞膜的作用。本研究证实，超高压和乳酸链球菌素结合处理能够有效抑制绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌的生长繁殖。

3 结论

超高压与乳酸链球菌素结合处理对分离自低温火腿中的典型腐败菌绿色魏斯菌和肠膜明串珠菌具有显著的协同抑制作用，200μg/mL的乳酸链球菌素结合500MPa，5min，20℃的超高压处理条件，能够彻底抑制绿色魏斯菌的生物活性。乳酸链球菌素的添加能够有效降低工业化生产中高压力水平的使用。

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Combined effect of ultra high pressure and Nisin on inactivation of spoilage pressure-resistant bacteria isolated from smoked cooked ham

WEN Si-ying1，HAN Yan-qing2，FANG Dong-lu1，CHEN Wei1，WU Ju-qing2，XU Xing-lian2，*
（1.College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；2.KeyLabofMeatProcessingandQualityControl，MinistryofEducation，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China）

The objective of this study was to evaluate the cooperate effect between high pressure and nisin content in inactivating pressure-resistant bacteria of cooked meat products.Typical spoilage pressure-resistant bacteria Weissella viridescens and Leuconostoc mesenteroides were treated with addition of 1～500μg/mL Nisin and also subjected to treatment at a range of high pressure from 100 to 600MPa（5min，20°C）.Standard culture methods were used to detecting the number of survivals.Results showed that，with the growing addition of nisin，numbers of the two bacteria were falling rapidly.When nisin content was up to 200μg/mL，these inactivate effect went to maximum.Significant reduction in bacteria numbers was found at high pressure treated at 400MPa and 300MPa for W.viridescens and L.mesenteroides，respectively.However，when high pressure treated with 200μg/mL Nisin，the pressure level fallen to 100MPa both for these two bacteria.High pressure treated at 500MPa for 5min at 20°C，with 200μg/mL Nisin content，could inactivate W.viridescens counts by 9lg（cfu/mL）.It provided evidence that there surely exist combined effect between high pressure and nisin when used for delaying bacteria grows.Nisin addition can effectively lower the pressure level used during industrial decontamination processes.

ultra high pressure；Nisin；pressure-resistant bacteria

TS251.1

A

1002-0306（2012）01-0059-04

2011－02－14 *通讯联系人

温斯颖（1991-），女，本科，研究方向：食品科学与工程。

国家大学生创新性实验计划课题（101030723）；江苏省普通高校研究生创新计划项目（CX10B_310Z）。