超声和均质对芸豆凝集素粗提物的影响

刘岑岑，任娇艳，赵谋明

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

超声和均质对芸豆凝集素粗提物的影响

刘岑岑，任娇艳*，赵谋明

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

采用两种工艺对四种芸豆中的凝集素进行提取，优化得到最佳的提取工艺；在此基础上研究了超声处理（包括料液比、超声功率、超声时间三个因素）和均质处理（包括均质压力、均质次数两个因素）对芸豆凝集素粗提物的得率及血凝活性的影响。结果表明：中山产红芸豆经过先匀浆再浸提工艺所得凝集素粗品得率最高，血凝活性最强；超声在一定范围内可以提高凝集素粗品得率和血凝活性，两者在料液比1∶15、超声功率325W、超声时间20min时有最大值；均质作用对芸豆凝集素粗品得率影响不大，在大于40MPa均质压力下循环作用两次血凝活性降低。

芸豆凝集素，超声，均质，得率，血凝活性

芸豆（Phaseolus vulgaris L.），又称腰豆、肾豆，属于菜豆属蝶形花科，原产于美洲的墨西哥、阿根廷。我国在16世纪末开始引进种植，主要种植地有四川、陕西、吉林、黑龙江、内蒙古，主要品种包括大白芸豆、大黑花芸豆、红芸豆[1-2]。芸豆籽粒营养丰富，而且具有抗肿瘤等药用价值，近年来研究结果表明这与芸豆中的凝集素有一定关系。芸豆凝集素（Phytohemagglutinin，PHA）是一类可促使红细胞凝集的糖蛋白[3]，具有促进免疫反应，诱发人外周血淋巴细胞产生抗癌淋巴因子以及抗HIV病毒等生物学活性[4-5]。同时，凝集素也是一类抗营养因子，其毒性主要是通过抑制肠道表面目标糖蛋白的消化和肠道刷状缘膜的活性，从而妨碍营养物质的吸收[6-7]。现代食品加工常常采用一些物理加工技术来改变食品的质构、风味以及营养价值，超声和均质技术就是目前常用的两种加工手段。超声作用的机制主要包括机械传质作用、加热作用和空化作用[8]；而均质作用的物理机制主要是利用液体物料流过狭缝受到的强大剪切力、撞击力以及压力突变产生的空穴爆炸力等综合作用导致大分子结构的变化[9]。本文利用超声和均质技术对芸豆进行加工处理，以凝集素粗品得率及血凝活性为指标研究其对芸豆凝集素的影响，为芸豆的生产加工提供指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红芸豆、花芸豆 产地中山；红芸豆、大白芸豆产地内蒙古；血红细胞（glutaraldehyde treated human group AB） Sigma公司；胰酶（pancreatin） 中性蛋白酶活力为2×103U/g，杭州三叶生物化工厂；0.9%的氯化钠溶液（生理盐水）；其他试剂 均为国产分析纯。高速冷冻离心机 德国博励行公司；超低温冷冻干燥机 德国Christ公司；DFT200型手提式高速万能粉碎机 温岭市林大机械有限公司；组织捣碎匀浆机 日本松下National公司；XO－640D型超声波细胞破碎仪 南京市先欧生物科技有限公司；APV－1000型均质机 丹麦APV产品公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芸豆凝集素的提取

1.2.1.1 工艺一 先匀浆后浸提。芸豆→去皮→按1∶10（m/v）加入生理盐水→匀浆→4°C浸提48h→四层纱布过滤→离心（10000r/min，40min）→冷冻干燥→凝集素粗品

1.2.1.2 工艺二 先磨粉后浸提。芸豆→去皮→粉碎→按1∶10（m/v）加入生理盐水→磁力搅拌1h→4°C浸提48h→四层纱布过滤→离心（10000r/min，40min）→冷冻干燥→凝集素粗品

1.2.2 血凝活性的测定 参照孙册等的方法[10]加以改进。用4×103U/L胰蛋白酶溶液处理红细胞，增强红细胞的敏感性[11]。以50%凝集作为判定终点，计算凝集效价和最低效价浓度。其中凝集效价以2n（n为血凝板上样品产生凝集现象的最大稀释倍数）表示。

1.2.3 超声对凝集素粗品的影响 以料液比（1∶3、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20）、超声功率（195、260、325、390、455W）和超声时间（5、10、15、20、25min）三个因素分别考察超声作用对凝集素粗品得率和血凝活性的影响。

1.2.4 均质对凝集素粗品的影响 以均质压力（10、20、30、40、50MPa）和循环次数（循环一次和循环两次）两个因素研究均质对凝集素粗品得率和血凝活性的影响。

1.2.5 数据分析 每个实验重复三次，采用SPSS 13.0软件进行One－way ANOVA分析。用LSD检验来确定数据间的差异，显著水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 不同提取工艺对芸豆凝集素得率的影响

图1 不同工艺提取的四种芸豆凝集素粗品得率的比较Fig.1 The comparison of crude PHA yields from four kinds of kidney bean by different extraction methods

由图1和表1可知，将芸豆先匀浆后浸提（工艺一）得到的四种凝集素粗品的得率与将芸豆先磨粉后浸提（工艺二）所得相似，平均略低1%左右，但是血凝活性均更高，凝集效价平均高1个单位。其原因可能有两个：粉碎粒度越小，溶出的其他杂蛋白质及糖类也相对越多，因而得率更高，但其中芸豆凝集素在粗提物中的比例反而下降；高速粉碎机转速很高，在粉碎过程中产生的短时高热使芸豆中部分凝集素失活。就四种芸豆进行比较，中山产红芸豆得率和血凝活性均最高，因此在后续实验中选取中山产红芸豆以工艺一提取凝集素粗品。

表1 不同工艺提取的四种芸豆凝集素粗品（25mg/mL）的血凝活性Table 1 The hemagglutination activities of crude PHA from four kidney beans by different extraction methods（25mg/mL）

2.2 超声对芸豆凝集素粗品得率及血凝效果的影响

2.2.1 料液比对芸豆凝集素粗品得率及血凝效果的影响 在超声时间15min，超声功率325W的条件下以不同料液比提取芸豆凝集素，研究料液比对其粗品得率及血凝效果的影响。

图2 料液比对芸豆凝集素粗品得率的影响Fig.2 The effects of the ratio of solid to liquid on the yield of crude PHA

由图2可知，芸豆凝集素粗品得率随着料液比的增大而增加。当料液比为1∶15时均基本达到最大值，超声组与对照组得率分别为26.20%和22.68%；继续增大料液比，凝集素粗品得率无显著增加（P＞0.05），说明增大料液比有助于细胞内溶物的溶出。与对照组比较，超声处理可显著增大芸豆凝集素粗品得率，可能原因是超声波的空化效应产生的微声流现象促进了细胞的破碎，使细胞内溶物质释放出来[12]。

表2 料液比对芸豆凝集素粗品（25mg/mL）血凝活性的影响Table 2 The effects of the ratio of solid to liquid on hemagglutination activities of crude PHA（25mg/mL）

由表2可知，一方面，增大料液比在一定程度上可以增大凝集素粗品的血凝活性；另一方面，与对照组比较，超声处理可使其血凝活性进一步增强。当料液比为1∶15时，经超声处理的凝集素粗品血凝活性最强，凝集效价为29，最低效价浓度为0.05mg/mL，比对照增强3个单位。综合比较，在料液比1∶15的超声作用下可以显著提高芸豆凝集素的得率和血凝活性。2.2.2 超声功率对芸豆凝集素粗品得率及血凝活性的影响 在料液比为1∶15，超声时间15min条件下，调节超声功率从30%增大到70%（总功率为650W），比较超声功率对芸豆凝集素粗品得率和血凝活性的影响。

图3 超声功率对芸豆凝集素粗品得率的影响Fig.3 The effects of ultrasonic power on the yield of crude PHA

由图3可知，超声功率从195W增加到325W，凝集素粗品得率显著增大，继续增大凝集素粗品的得率增加不显著（P＞0.05）。此时其得率为26.20%，比初始时（超声功率195W）增大了13%，比对照增大了15%。

表3 超声功率对芸豆凝集素粗品（25mg/mL）血凝活性的影响Table 3 The effects of extraction power on hemagglutination activities of crude PHA（25mg/mL）

图4 超声时间对芸豆凝集素粗品得率的影响Fig.4 The effects of ultrasonic time on the yield of crude PHA

由表3可知，当超声功率增大到260W，芸豆凝集素粗品的血凝活性基本达最大值，凝集效价28，最低效价浓度0.10mg/mL，比对照组增大1个单位；超声功率继续增加，血凝活性基本不变。综合比较，在超声功率为325W时可以得到最优的得率与血凝效果。

2.2.3 超声时间对芸豆凝集素粗品得率及凝血活性的影响 在料液比1∶15，超声功率325W条件下，研究超声时间对芸豆凝集素粗品得率及血凝活性的影响。由图4可知，芸豆凝集素粗品的得率随着超声时间的延长而增大。当超声时间达20min时，芸豆凝集素粗品得率基本达到最大值（26.79%），比超声5min时增大9.6%，比对照组增大19.3%。对比可知，超声时间5min以上均能增大其得率，在超声20min后得率增大不显著（P＞0.05），这与L.Anta等[7]研究结果相一致。

表4 超声时间对芸豆凝集素粗品（25mg/mL）血凝活性的影响Table 4 The effects of ultrasonic time on hemagglutination activities of crude PHA（25mg/mL）

由表4可知，超声时间在10min以下时，芸豆凝集活性无明显增强。超声时间延长到15min时，凝集活性增强，凝集效价增大1个单位，最低效价浓度为0.1mg/mL；继续增大超声时间到20min时，凝集活性保持不变；但是当超声时间继续延长至25min时，凝集活性反而降低。可能原因是由于芸豆凝集素为一种四聚体球蛋白，其血凝活性与聚合物的聚合和分离状态有关，而超声空化作用会先使球蛋白解离然后聚合，所以随着超声时间的延长使芸豆凝集素的聚合状态发生了较大的变化，进而使血凝活性降低[13]。另外，也可能是由于超声时间过长产生的局部高热效应使部分凝集素糖蛋白变性，而使其凝集活性降低。

2.3 均质对芸豆凝集素粗品得率及血凝效果的影响

图5 均质对芸豆凝集素粗品得率的影响Fig.5 The effects of homogenization on the yield of crude PHA

由图5可知，均质作用对芸豆凝集素粗品得率无明显作用，可能是因为普通均质的压力比较低，产生的物理机械的作用对芸豆细胞的破坏作用较弱，不能促进其释放出更多的内溶物。

表5 均质对芸豆凝集素粗品（25mg/mL）血凝活性的影响Table 5 The effects of homogenization on hemagglutination activities of crude PHA（25mg/mL）

由表5可知，在只循环一次的不同均质压力处理下，凝集素的血凝活性基本不变，但是在较高压强（40MPa和50MPa）作用下循环两次，凝集素的凝集效价降低一个单位，最低效价浓度增大到0.39mg/mL。可能原因是在较高压力的作用下，由于增加循环次数即延长了均质作用时间，对凝集素分子结构的解离和聚合有一定影响，从而使其凝集活性降低，具体变化机理还有待进一步研究[14]。

3 结论

3.1 采用将芸豆先匀浆后浸提工艺提取效果更佳，其凝集素粗品得率与将芸豆先磨粉后浸提工艺所得到的凝集素粗品得率相近（平均略低1%），但是其血凝活性更强（血凝效价平均高出1倍），另外，中山产红芸豆凝集素粗品得率最高且血凝活性最强。

3.2 在一定范围内，超声可显著增强芸豆凝集素粗品的得率和血凝活性。在本实验条件下，在料液比1∶15、超声功率325W、超声时间20min对芸豆凝集素影响最大，此时凝集素粗品得率最大，血凝效果最强。

3.3 普通均质作用下不能显著改变芸豆凝集素粗品的得率，但是在大于40MPa的均质压力下循环作用两次对凝集素的血凝效果有一定的破坏作用，凝集效价降低一个单位。

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Effect of ultrasonic probe and homogenization on crude phytohemagglutinin（PHA）from kidney bean

LIU Cen-cen，REN Jiao-yan*，ZHAO Mou-ming
（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

Crude phytohemagglutinin（PHA）from four kinds of kidney bean was extracted by different processes. Besides，the effects of three factors（the ratio of solid to liquid，ultrasonic time and ultrasonic power）of ultrasonic processing and two factors（the pressure and circle time）of homogenization on crude PHA were studied as well.It was found the crude PHA extracted from red kidney bean produced at Zhongshan had the strongest hemagglutination activities and the highest yield among four kinds of kidney bean.Ultrasonic treatment could improve the yield and the hemagglutination activities of crude PHA in a certain range，which reaching the maximum at the ratio of solid to liquid 1∶15，the ultrasonic power 325W and the ultrasonic time 20min.Homogenization followed by extraction had little effect on crude PHA yield，while the hemagglutination activities decreased after the second circle when the pressure was higher than 40MPa.

phytohemagglutinin；ultrasonic probe；homogenization；yield；hemagglutination

TS214.9

A

1002-0306（2012）01-0115-04

2011－01－04 *通讯联系人

刘岑岑（1988-），女，硕士研究生，主要从事食品生物技术的研究。

国家自然科学基金项目（31000759）；华南理工大学中央高校基本科研业务费专项资金资助（2009ZM0152）；华南理工大学自然科学基金（x2qsE5090560）。