枇杷花提取物抗氧化活性研究

闫永芳，孙 钧，孟天真，叶兴乾

（1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州310029；2.浙江省农业厅经济作物管理局，浙江杭州310020）

枇杷花提取物抗氧化活性研究

闫永芳1，孙 钧2，孟天真1，叶兴乾1

（1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州310029；2.浙江省农业厅经济作物管理局，浙江杭州310020）

采用DPPH、ABTS、FRAP和福林酚（F－C）四种方法测定枇杷花酚类化合物的抗氧化活性，比较最优条件下蒸馏水、甲醇、乙醇三种溶剂的提取效率。结果表明，DPPH、ABTS、F－C法所测抗氧化活性顺序一致，即为水提物＞甲醇提取物＞乙醇提取物，但当量大小有所差异，其中F－C实验结果最大；FRAP实验中，甲醇提取物抗氧化活性略大于水提物，乙醇提取物活性最低。其原因可能是由于提取溶剂极性不同，反应机理不同，FRAP法基于单电子转移原理。因此，枇杷花酚类物质在乙醇中的溶解性较差。

枇杷花，DPPH，ABTS，F－C，FRAP，抗氧化

枇杷花，为蔷薇科枇杷属植物枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）的花，既可作为饮品也可入药，具有化痰止咳、和胃降气的功效[1]。因枇杷花药食功效显著，近年来，有关枇杷花的深加工产品越来越受广大消费者欢迎，因此有必要对枇杷花功能性成分做深层次的研究。食品中的酚类化合物作为一种具有生物活性的功能性成分，备受关注。大量流行病学研究表明，酚类化合物具有淬灭单线态氧和清除自由基的作用[2]，与一些疾病的预防有密切关系，如各种癌症、心血管和神经性疾病以及衰老引起的相关疾病[3]。目前，受消费者喜爱的一些饮品，如红酒和可可饮料都富含酚类抗氧化物[4－5]。其次，酚类物质还能赋予食品特殊的感官品质，如红酒，它可以赋予红酒一些特有的感官特性，如色泽、涩味等[6]。酚类物质还具有抗病毒、抗菌作用，显著提高内皮功能[7]，此外，酚类物质是提高食品品质、延长保质期的功能性物质[8]。因此，评价消费食品的抗氧化能力意义重大。本实验在以蒸馏水、甲醇和乙醇为最优萃取条件前提下，采用DPPH、ABTS、福林酚（F－C）和FRAP四种方法比较枇杷花提取物的抗氧化活性，为进一步研究枇杷花中酚类化合物组成提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

宁海白枇杷 2009年11月采集自浙江省宁波市宁海县（东经121°25′、北纬29°17′），采集的鲜枇杷花置于样品袋中6h内运回实验室并进行及时处理，将采集样品过筛，收集花瓣，置于60℃干燥箱内鼓风干燥过夜，磨粉，储存备用；Fe3+－三吡啶三吖嗪（Tripyridyl－triazine，TPTZ）、ABTS[2，2’－Azinobis（3－ethylbenzothiazoline 6－sulphonate）]、6－羟基－2，5，7，8－四甲基色满－2－羧酸（Trolox）、1，1－二苯基－2－苦基苯肼（1，1－Diphenyl－2－picryl－hydrazyl，DPPH）、福林酚试剂（Folin－Ciocalteu reagent）、没食子酸（Gallic acid） 均购自Sigma公司；甲醇、乙醇、盐酸等 均为分析级。

离心机KA－1000 上海安亭科学仪器厂；UV－2550紫外/可见分光光度计 日本SHIMADZU公司。

1.2 枇杷花有效成分的提取

分别采用水、甲醇、乙醇热回流浸提枇杷花中有效成分。料液比1∶15，回流提取2次，每次1.5h，旋转蒸发除去溶剂，经冷冻干燥分别得到三种溶剂抗氧化活性粗提物。分别配制一定浓度的样品甲醇溶液备用。

1.3 抗氧化活性评价

1.3.1 DPPH自由基清除实验 测定方法参考文献[9]并略有改动。配制0.1mmol/L的DPPH试剂，取0.1mL提取液与3.9mLDPPH试剂混合，在暗处反应0.5h，随后在515nm下测定吸光值。根据样品吸光值的变化计算抑制率：

式中：A0为空白对照的吸光值，A1为样品的吸光值。

以Trolox作为标样制作标准曲线，结果以Trolox当量TE（Trolox equivalent）表示。

1.3.2 ABTS自由基清除实验[10]取440μL 140mmol/L的过硫酸钾溶液加入到25mL 7mmol/L的ABTS溶液中混合，避光反应12～16h。测定之前加入乙醇将ABTS溶液稀释至吸光值为0.700±0.002（734nm下）。将3.9mL的ABTS溶液与0.1mL经稀释的提取液混合、摇匀，在室温下反应6min后，在734nm条件下测定其吸光值。抑制率计算方法及标准曲线的制作同1.3.1。

1.3.3 FRAP实验 参考文献[11]方法并略作改动。FRAP试剂的配制为0.1mol/L醋酸缓冲液（pH3.6）∶10mmol/L的TPTZ溶液（溶于40mmol/L盐酸）∶20mmol/L三氯化铁= 10∶1∶1。取3.9mL FRAP试剂与0.1mL的样品混合反应10min后，于593nm下测定吸光值。空白对照为0.1mL提取溶剂。以Trolox作为标样制作标准曲线，结果用Trolox当量TE（Trolox equivalent）表示。

1.3.4 福林酚法（F－C） 参考文献[12]并略有改动。取枇杷花提取液0.25mL，加入到25mL具塞试管中，同时加入0.25mL F－C试剂，在暗室中反应3min。加入2mL浓度为5%的碳酸钠溶液，加蒸馏水至15mL，在暗室中反应25min。并在750nm下测定吸光值。以没食子酸作为标样制作标准曲线，抗氧化活性用没食子酸当量GAE（Gallic acid equivalent）表示。

1.4 数据处理

所有实验重复三次，结果以平均值±SD标示。数据结果进行方差分析，显著水平P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 清除DPPH·的能力

DPPH自由基清除实验是常用的体外抗氧化活性评价方法之一。该方法对反应物有一定的选择性，且达到稳定所需时间长。枇杷花的不同溶剂提取物对DPPH·的清除能力结果如表1所示。清除DPPH自由基能力的次序为VC＞水提物＞BHA＞VE＞甲醇提取物＞乙醇提取物，其中VC效果最好（0.065mg/mL）；水提物在该实验中也表现出良好的效果，IC50值为0.105mg/mL，低于阳性对照BHA（0.126mg/mL）和VE（0.135mg/mL）；甲醇和乙醇提取效果较差，IC50值分别为0.165mg/mL和0.203mg/mL。

表1 枇杷花不同溶剂提取物清除DPPH·、ABTS+·能力比较Table 1 Comparison of scavenging DPPH·，ABTS+·capacities of extracts with different solvents

2.2 清除ABTS+·的能力

ABTS实验结果如表1所示，ABTS实验中各枇杷花提取物的抗氧化活性的强弱顺序与DPPH实验组结果类似，即VC＞水提物＞BHA＞VE＞甲醇提取物＞乙醇提取物，但IC50值略低。VC的抗氧化活性最强（0.074mg/mL），水提物IC50值为0.081mg/mL，低于阳性对照BHA（0.102mg/mL）和VE（0.140mg/mL）；甲醇提取物活性稍强于乙醇提取物，其IC50值分别达到0.146mg/mL和0.157mg/mL。由实验结果可知，DPPH法与ABTS法所得实验结果的总体趋势非常相似。

2.3 FRAP实验测定抗氧化能力

FRAP实验结果如表2所示。由表2可以看出，FRAP测试体系中，不同溶剂提取物的抗氧化活性次序为甲醇提取物（49.61mgTE/g）＞水提物（48.76mgTE/g）＞乙醇提取物（23.99mgTE/g）。与其他实验结果相比，FRAP甲醇提取物活性高于水提物，这与DPPH、ABTS和F－C的实验结果略有不同。这可能是由于反应机理不同所致：FRAP法基于单电子转移机理，而ABTS、DPPH、F－C则由单电子转移和氢原子转移共同发生作用[12]。由此进一步验证，不同方法其抗氧化活性测定结果有很大差异，不能仅用单一方法评价抗氧化活性[13－14]。

2.4 F-C法测定抗氧化活性

F－C法是一种使用非常广泛的总酚测定方法。参考文献[12]，在此基础之上经过略微改动，与其他方法结合测定枇杷花提取物的抗氧化活性。酚类物质可以参与到氧化还原反应中，与抗氧化能力有很大的相关性。由表2可以看出，F－C实验中水提物约为甲醇提取物活性的2.4倍（GAE分别为137.90mgGAE/g和56.76mgGAE/g），是乙醇提取物活性的4.1倍（GAE为33.47mgGAE/g），其整个趋势与DPPH、ABTS实验结果非常相似。值得注意的是没食子酸当量在33mgGAE/g和140mgGAE/g之间，测定结果高于其他实验所得结果。原因可能是该方法并不仅限于酚类物质，很多非酚类物质，如抗坏血酸以及一些糖类化合物，同样可以与F－C试剂反应[15]；其次，有报道没食子酸作标准时其反应活性和吸收值较Trolox高[16]，这也可能致使F－C法实验结果偏高。

3 结论

DPPH、ABTS和F－C实验中，枇杷花的水、甲醇和乙醇三种溶剂提取物的抗氧化活性强弱顺序基本一致，水提物＞甲醇提取物＞乙醇提取物，其中F－C实验结果当量数值最大；FRAP实验敏感性较差，TE值较低，且三种溶剂提取物的抗氧化活性强弱顺序略有不同。通过四种抗氧化活性评价方法比较得出，枇杷花水提物和甲醇提取物的抗氧化活性要高于乙醇提取物。因此，可以推断枇杷花中的酚类化合物在乙醇中溶解得较少。本实验为枇杷花中酚类物质的进一步研究提供了理论依据。

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Antioxidant capacities of loquat flower extracts using different solvents

YAN Yong-fang1，SUN Jun2，MENG Tian-zhen1，YE Xing-qian1
（1.College of Biosystem Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China；2.Industrial Crop Bureau，Agriculture Department of Zhejiang Province，Hangzhou 310020，China）

DPPH，ABTS，FRAP and F-C methods were used to analyze the antioxidant capacity of loquat flowers extracts.The results showed that water extracts exhibited the highest antioxidant capacity，followed by methanol extracts and ethanol extracts in the three methods（DPPH，ABTS，F-C）.In the FRAP method the methanol extracts showed higher antioxidant capacity than the water extracts.That may be due to different extract solvents and different reaction mechanisms.In general，the ethanol extracts exhibited the lowest antioxidant capacity.

loquat flower；DPPH；ABTS；F-C；FRAP；antioxidant capacity

TS255.1

A

1002－0306（2012）01－0122－03

2010－12－20

闫永芳（1987－），女，硕士研究生，研究方向：食品工艺、食品安全及控制技术。

教育部创新工程重大项目培育资金项目（707034）；浙江省重大科技专项重点项目（2008C02005－2）；中央高校基本科研业务费专项资金资助。