传统豆渣菌的菌相分析及蛋白酶和纤维素酶主要产生菌株的鉴定

张燕鹏，杨瑞金，王 贺，蒋孝燕

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学食品学院，江苏无锡214122）

传统豆渣菌的菌相分析及蛋白酶和纤维素酶主要产生菌株的鉴定

张燕鹏1，杨瑞金2，*，王 贺1，蒋孝燕1

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学食品学院，江苏无锡214122）

对江西瑞金的特色发酵食品-豆渣菌进行了菌相分析，结果表明豆渣菌是以真菌和细菌为主的混合型发酵食品。真菌主要为串珠霉属（Monilia）、根霉属（Rhizopus）和酵母属（Saccharomyces）；细菌主要为微球菌属（Micrococcus）葡萄球菌属（Staphylococcus）、片球菌属（Pediococcus）、异常球菌属（Deinococcus）、肠杆菌属（Enterobacterspp），非乳杆菌属和三株枯草芽孢杆菌（B.subtilis）。串珠霉属真菌具有纤维素酶和蛋白酶活力，枯草芽孢杆菌和根霉属真菌则具有蛋白酶活力。

豆渣菌，菌相分析，纤维素酶，蛋白酶

豆渣是豆制品加工过程中主要的副产品，通常含有约50%的纤维、20%的蛋白质和10%的油脂[1]。C. Y.Ma，W.S等的研究结果表明，豆渣中的蛋白质含有丰富的必需氨基酸，并且具有较高的体外消化率[2]；豆渣中的膳食纤维可以有效清除人体内的脂肪[3-4]。然而，由于豆渣纤维素含量较高，口感较差，所以目前豆渣的利用率较低，主要是将豆渣作为动物饲料直接喂养动物。在江西瑞金等地有一种传统发酵食品——“豆渣菌”，是以新鲜豆渣为原料通过传统发酵技术制备而成，具有很好的鲜味和口感，往往被作为汤料或者直接烹饪，已经成为当地的一种传统美食。国内的余永红、邓泽元[5]等人从传统“豆渣菌”中分离出了产纤维素酶的菌株，但对于“豆渣菌”的具体菌相分析未见报道。本文的目的是通过对传统“豆渣菌”微生物菌相的系统分析，特别是产纤维素酶和蛋白酶主要菌株的鉴定，为改进“豆渣菌”传统生产工艺，提高生产效率和产品质量提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

豆渣菌 购于江西瑞金农贸市场；大豆浓缩蛋白培养基（g/L） 蛋白胨0.5，酵母膏0.3，大豆浓缩蛋白10.0，琼脂15，pH7.0；纤维素培养基（g/L） 羧甲基纤维素钠20，蛋白胨5，酵母膏0.5，脱氧胆酸钠0.5，琼脂15，pH5.0；豆浆试管培养基 15mm×150mm试管中装豆浆60mm，pH自然。

1.2 豆渣菌的菌相分析

1.2.1 样品的处理 从不同部位共取样品25g，在无菌条件下研磨，然后放入225mL带玻璃珠的无菌稀释液中（含0.1%蛋白胨和0.85%氯化钠），振荡20min后制备成样品均液备用。

1.2.2 微生物分离纯化 样品均液经适当稀释后，取0.1mL进行涂平板。细菌分离采用营养琼脂培养基，置于37℃下培养24h，霉菌和酵母菌分离采用马丁氏琼脂培养基和孟加拉红培养基，置于28℃下培养24～72h。微生物长出单菌落后再反复进行平板划线分离以得到纯株。

表1 豆渣菌分离的细菌形态特征Table 1 Morphological characteristics of bacteria from Douzhajun

1.2.3 优势菌群的鉴定

1.2.3.1 细菌鉴定 参考《伯杰氏细菌鉴定手册》[6]和《常见细菌系统鉴定手册》[7]进行生理生化实验鉴定，芽孢杆菌结合16S rRNA进行鉴定。

1.2.3.2 真菌鉴定 对真菌进行载片培养[10]和点植法观察，并参考《常见与常用真菌》[8]和《真菌鉴定手册》[9]进行鉴定。

1.2.3.3 酵母鉴定 观察酵母菌的菌落和菌体形态，并参考《酵母菌的特征与鉴定手册》[11]进行鉴定。

1.3 芽孢杆菌的16S rRNA鉴定

使用试剂盒提取芽孢杆菌总DNA，采用通用引物F（5’-AG AG TTTG ATCCTG G CTCAG-3’）及R（5’-TACG G CTAC CTTG TTACG ACTT-3’）利用PCR扩增供试菌株的16S rDNA片段。用标准的PCR反应体系进行扩增，反应体系为25μL：10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L MgCl21.5μL，dNTP（2.5mmol/L）2.0μL，引物F（20μmol/L）0.5μL，引物R（12μmol/L）0.5μL，TapDNA聚合酶（5U/μL）0.25μL，细菌总DNA稀释适当倍数（×50）0.5μL，ddH2O 17.25μL。循环条件：94℃，4min；94℃，1min；55℃退火1min；72℃延伸2min；35个循环；72℃延伸10min。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，VDS成像检测。在紫外灯下切下目的DNA，使用试剂盒回收目的DNA，纯化的DNA产物连入PGM-T载体，转入E.coli DH5α感受态细胞，转化子在含X-gal和氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆，然后提取质粒进行测序。所测定得到的16S rDNA序列输入GenBank，用Blast软件进行序列比对，并申请获得GenBank的登录号。

1.4 蛋白酶产生菌的确定

把挑选到的优势菌株分别点接到大豆浓缩蛋白培养基上，放置适宜培养温度下培养3d，每个菌株做2次重复，通过计算蛋白质降解的透明圈与菌落直径的比值，来判定产蛋白酶的活力。

1.5 纤维素酶产生菌的确定

把挑选到的优势菌株点接到羧甲基纤维素钠培养基上，放在适宜的温度下培养3d，向培养基中加入适量的1mg/mL刚果红溶液，染色1h，弃去染液后，加入适量1mol/L的NaCl溶液，洗涤1h，通过观察菌落周围清晰的透明圈来判定产纤维素酶的活力[12]。

2 结果与分析

2.1 细菌菌落特征的观察

表2 球菌生理生化实验Table 2 Physiological and biochemical experiment of Cocci

表3 革兰氏阴性杆菌的生理生化实验Table 3 Physiological and biochemical experiment of Gram-negative bacilli

细菌经在营养琼脂上分离培养后通过菌落和细胞形态观察，其形态特征如表1所示。从表1可以看出，分离的菌株中有3株为芽孢杆菌，5株为球菌，2株为革兰氏阴性杆菌，5株为无芽孢的革兰氏阳性杆菌。进一步对不同细菌做生理生化实验，如表2～表4所示。通过生理生化实验，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》初步鉴定B1为微球菌属（Micrococcus）；B2为葡萄球菌属（Staphylococcus）；B6为片球菌属（Pediococcus）；B8和B10为异常球菌属（Deinococcus）；B3、B5属于肠杆菌属（Enterobacterspp）；B4、B7、B9、B11、B12为非乳杆菌属，在《伯杰氏细菌鉴定手册》中归为位置不确定的属。

表4 无芽孢的革兰氏阳性杆菌的生理生化实验Table 4 Physiological and biochemical experiment of Gram-positive asporogenous bacilli

表5 霉菌菌落和形态特征Table 5 Colonial and morphological characteristics of fungi

2.2 芽孢杆菌的16S rRNA鉴定

PB13、PB14、PB15经过细胞观察可以初步确定为芽孢杆菌属，再通过16S rRNA对这三株芽孢杆菌进一步鉴定。经序列测定，确定这三株芽孢杆菌的扩增片断长度为1515、1513、1514bp，序列提交GenBank获得的登录号分别为：HM047561、HM047563、HM047562。经核酸同源性分析，这三株菌都与枯草芽孢杆菌的同源性达到99%以上，可以确定这三株细菌都属于枯草芽孢杆菌（Bacillus.subtilis）。

2.3 霉菌菌落观察和鉴定

分离的2株霉菌的菌落和菌体形态及产孢结构如表5所示。通过对菌落和菌体形态及菌丝产孢结构的观察，并参考《常见与常用真菌》和《真菌鉴定手册》，可以鉴定F1为串珠霉属（Monilia），F2为根霉属（Rhizopus）。

2.4 酵母菌菌落形态和鉴定

对酵母菌Y1和Y2的菌落和菌体形态观察如表6所示，通过参考《酵母菌的特征与鉴定手册》，可以鉴定Y1和Y2都属于酵母属（Saccharomyces）。

表6 酵母菌菌落和形态特征Table 6 Colonial and morphological characteristics of yeast

2.5 产蛋白酶和产纤维素酶菌株的确定

豆渣中含有20%左右的蛋白质，蛋白质的降解对豆渣菌的鲜味、风味和功能性质起重要作用。为了更针对性地确定可以降解大豆蛋白的菌株，分别使用大豆浓缩蛋白和豆浆为底物来筛选产蛋白酶的细菌和霉菌。另外豆渣中富含膳食纤维，约占豆渣干重的55%左右，但由于纤维素含量高、纤维颗粒大，其口感粗糙，将纤维素适当降解，对提高可溶性膳食纤维和改善豆渣的口感都有重要的意义。因此，筛选出产蛋白酶和纤维素酶的菌株对豆渣菌发酵工艺的研究有着重要意义。表7表明，细菌中主要是三株枯草芽孢杆菌产生蛋白酶，其中枯草芽孢杆菌PB14的透明圈和菌落直径比为2.43，PB13和PB15分别为2.09和2.11，说明枯草芽孢杆菌PB14具有较强的产蛋白酶活力；通过接种豆浆培养基发现真菌F1和F2均具有蛋白酶活力，可以在5d内降解大豆蛋白，使豆浆变得澄清。对于纤维素酶而言，发现仅霉菌F1可以明显降解纤维素产生透明圈，其他菌株均不具有纤维素酶的活力。

表7 分离菌株的蛋白酶和纤维素酶活力Table 7 The proteolytic and cellulose activity of the strain

3 结论

菌系分析表明，豆渣菌主要是以霉菌中的串珠霉属（Monilia）为主，还含有根霉属（Rhizopus）和酵母属（Saccharomyces）；细菌主要是杆菌和球菌，其中杆菌主要是枯草芽孢杆菌（Bacillus.subtilis）、肠杆菌属（Enterobacterspp）、非乳杆菌属；球菌含有葡萄球菌属（Staphylococcus）、片球菌属（Pediococcus）和异常球菌属（Deinococcus）。串珠霉属霉菌主要产纤维素酶和蛋白酶，而枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、根霉属（Rhizopus）霉菌主要产蛋白酶。这些菌有效地降解了豆渣中的纤维素和蛋白质，使其可溶性膳食纤维增加。大分子的蛋白质降解为肽类和氨基酸，从而有利于人体的吸收和利用，并对豆渣菌的口感及鲜味起一定的作用。而豆渣菌中的球菌和肠杆菌属，非乳杆菌属对风味是否起作用，并且是否是有害菌有待进一步的探讨。

发现及发掘豆渣菌中的优势和有益菌种，并对其发酵特性进行针对性的研究，可以更好地将其运用到以后的豆渣发酵中，以便提供更为安全和美味的发酵产品，使豆渣菌这一具有地方特色的发酵食品得到更为广泛的发展。

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Analysis of the microflora and identification of the protease and cellulase producing strains from the traditional fermentative Douzhajun

ZHANG Yan-peng1，YANG Rui-jin2，*，WANG He1，JIANG Xiao-yan1
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The microflora of Douzhajun，a traditional okara-fermented food，was analysed.The result indicated that Douzhajun was a food fermented mainly by fungi and bacteria.The fungi included the Monili.Rhizopu.and Saccharomyce，and the bacteria included Staphylococcus，Pediococcus，Deinococcus，Enterobacterspp，non-Lactobacillus and three strains of B.subtilis.Monilia.was able to secrete the cellulase and protease，the B. subtilis and Rhizopus were able to secrete the protease.

Douzhajun；analysis of microflora；cellulose；protease

TS201.2

A

1002-0306（2012）01-0171-04

2010－09－14 *通讯联系人

张燕鹏（1980-），男，博士研究生，研究方向：植物蛋白工程。