高温变性豆粕发酵菌株的选育

赵伟华，程建军，杨秋萍，任为聪

（东北农业大学，黑龙江哈尔滨150030）

高温变性豆粕发酵菌株的选育

赵伟华，程建军*，杨秋萍，任为聪

（东北农业大学，黑龙江哈尔滨150030）

以米曲霉CICC40186为出发菌株，经紫外诱变处理后，获得对高温变性豆粕分解能力强的突变菌株8421和8422。与出发菌株相比，两突变株所产酸性、中性和碱性三种蛋白酶分别提高了73.2%、91.2%，81.1%、83.7%，37.6%、32.9%；三氯乙酸（TCA）可溶性蛋白含量分别提高了约13.0%和13.2%。经6次传代，遗传性状稳定。

米曲霉，紫外诱变，蛋白酶，TCA可溶性蛋白

米曲霉（Aspergillus oryzae）由于其酶系丰富，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等，因而受到人们的广泛关注。在蛋白酶的作用下，可以将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。2005年，国外学者完成了对米曲霉基因组的破译[1]。米曲霉中由于没有产黄曲霉毒素的完整基因组，进一步证明了米曲霉在发酵工业中的安全性[2]。国内对于米曲霉的研究主要集中在如何利用米曲霉提高食品酿造业的生产效率和产品质量上。发酵菌种的特性决定了生产的工艺，所以近年来人们不断通过各种诱变手段获得新的菌株。如采用NTG和UV复合诱变，选育出一株中性蛋白酶活力高、生长快、对米渣分解能力强的优良菌株，中性蛋白酶活力较原菌株提高了32.6%，使得用米渣制成含有多种氨基酸的蛋白质水解液成为可能[3]。利用N+注入法进行诱变，突变株TK-7DE的蛋白酶活力较原菌株提高了36%[4]。紫外线诱变由于其诱变频率高，不易回复突变，所以一直在工业微生物育种史上发挥着极其重要的作用。利用紫外线对野生米曲霉进行诱变选育，蛋白酶活力得到大幅度提高，用其发酵制酱，与工业上普遍应用的米曲霉沪酿3.042做比较，氨基酸态氮有所提高，差异性显著[5]。周其洋对米曲霉1-7.3进行紫外诱变，所得菌株酸性蛋白酶和中性蛋白酶分别比出发菌株提高了230.10%和17.5%[6]。但是国内利用米曲霉在制酱及酱油中多是采用豆饼或者低温变性豆粕为底物。高温变性豆粕是大豆炼油后的副产物，炼油工艺中高温脱溶步骤造成蛋白质的热变性，导致了高温变性豆粕的蛋白质溶解性较差，蛋白利用率低。而由于米曲霉的酶系作用，对底物作用的活力位点不同[7]，因此通过诱变选出对高温变性豆粕分解能力强的菌株有利于高温变性豆粕的开发与利用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

米曲霉CICC40186 中国工业微生物菌种保藏中心；高温变性豆粕 黑龙江省双鸭山市杨霖油脂厂；PDA培养基 马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L；初筛培养基 干酪素4g/L，KH2PO40.36g/L，Na2HPO41.07g/L，CaCl20.002g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，琼脂20g/L，pH6.5～7.0；发酵培养基 高温变性豆粕16g，葡萄糖4g，水200mL，装入500mL三角瓶中。

1.2 实验方法

1.2.1 诱变实验

1.2.1.1 紫外诱变 将紫外线灯打开稳定约20min，取调整好孢子浓度的孢子悬液10mL置于无菌的培养皿中。再将上述培养皿置于磁力搅拌器上，打开皿盖，距离紫外线灯下30cm分别照射2、4、6、8、10min。取经紫外线辐射的孢子悬液1mL，加入到装有9mL生理盐水的无菌试管中，按梯度（102～l06）逐一稀释。每个稀释度取孢子悬液0.1mL进行平板涂布，重复3～5次。30℃下于恒温培养箱中避光培养1d后，光照培养。同样方法，取未经紫外线处理的孢子悬液稀释涂布作为对照，确定最佳紫外照射时间，并计算出相应的致死率和正突变率。

1.2.1.2 初筛 将最佳紫外照射时间的菌株在初筛培养基中培养，分别在3、4、5d时测量菌株的水解圈和菌落直径。计算R值。选择R值大于出发菌株的菌落作为目标菌株，转接到PDA斜面培养基上，培养保藏备用，并确定最佳培养时间即复筛时间。

1.2.1.3 复筛 将培养4d的PDA斜面加入5mL无菌水，振荡30s，血球计数板计数，调整孢子浓度为106个/mL，按10%（v/v）的接种量接种于发酵培养基中，于30℃，160r/min摇床振荡培养4d，以蛋白酶活和TCA可溶性蛋白含量为检测指标进行复筛。

1.2.1.4 遗传稳定性测定 选出蛋白酶活力和TCA可溶性蛋白含量高的菌株做遗传稳定性实验，观察其遗传稳定性。传代的菌株同样制备种子液，接种于发酵培养基，测定酶活和TCA可溶性蛋白含量。

1.2.2 测定方法

1.2.2.1 蛋白酶活力的测定 采用SB/T 10317-1999，Folin-酚法进行测定。

1.2.2.2 TCA可溶性蛋白含量的测定 参照文献[2]，略加修改。将等体积的TCA（0.4mol/L）加入到发酵液中，静置0.5h，后以4000r/min离心20min，去除沉淀，凯氏定氮法测定上清液中的蛋白含量。

1.2.3 数据统计 本实验利用EXCEL2003进行数据分析。采用SPSS13.0统计软件中的方差分析进行单因素方差分析，并用Duncan检验法做多重比较，进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 紫外照射时间对致死率和正突变率的影响

由图1可知，随着紫外照射时间的延长，致死率呈现出正相关性。在10min的时候达到100%。正突变率则先随时间增长而增大，于4min时达到最大，为22.99%，之后呈现出下降趋势。8min时，正突变率为19.54%，虽然此时菌株正突变率数量小于4min时，但8min时正突变菌株R值增大效果普遍大于4min时的R值增大效果，正突变率效果好。所以本实验选取8min为最佳诱变时间。此时，致死率达到85.8%。

图1 诱变时间与致死率和正突变率之间的关系Fig.1 Effect on proportion of deadly and mutation with UV

2.2 紫外诱变的初筛

表1 菌株初筛结果（mm）Table 1 Prescreening result of strains（mm）

由表1可知，所选菌株与原菌株比较，R值均有所增大，全部确定为复筛菌株。菌株的直径和水解圈的直径随着时间而逐渐增大，R值在第3d到第4d期间有所增长，第5d变化不大，甚至呈现减小趋势。说明米曲霉所产的蛋白酶在第4d时达到最大。第5d时，米曲霉已进入衰亡期，菌株在生长，但产酶能力已经下降，所以确定复筛的时间为4d。

但有的学者认为水解圈大的菌株酶活不一定高[8-9]，本研究为了验证酶活和水解圈的关系，以R值为横坐标，酶活为纵坐标作图，采用一元线性回归进行分析，结果见图2和表2。

从图2中可以看出，R值在1.24到1.65之间，三种蛋白酶活与R值在总体上存在着一定的线性关系。由表2可知，酸性蛋白酶与中性和碱性蛋白酶相比较，相关系数较大，为0.9289。说明R值与酸性蛋白酶之间存在着较好的线性关系。中性蛋白酶和碱性蛋白酶相关系数小于酸性蛋白酶，分别为0.8308和0.8055，存在一定的相关性。虽然相关性不是极显著，但可以在一定程度上反映出R值越大，酶活越高。且三种蛋白酶均具有显著的统计学意义（plt;0.05）。所以，为了大量减少劳动量，可以认为水解圈与菌株直径的比值能够作为产酶能力大小的指标进行初筛，这与刘军[10]的报道一致。

图2 R值与酶活和TCA可溶性蛋白含量的相关性分析Fig.2 The correlation of R with enzyme activity and TCA soluble protein content

表2 相关性分析结果Table 2 The results of correlation analysis

2.3 紫外诱变的复筛

利用发酵培养基进行液态发酵，测定各菌株蛋白酶活力和TCA可溶性蛋白含量，结果见表3。

表3 各菌株蛋白酶活力和TCA可溶性蛋白含量比较Table 3 Contrast of different strains'activity of protease and TCA soluble protein

由表3可知，诱变得到的8株米曲霉在三种蛋白酶活及TCA可溶性蛋白含量方面与原菌株相比，均有较大程度的提高，且米曲霉8421和8422提高程度尤为显著。两菌株所产蛋白酶中酸性、中性、碱性蛋白酶分别提高了73.2%，91.2%；81.1%，83.7%；37.6%，32.9%；TCA可溶性蛋白含量分别提高了约13.0%和13.2%；与原菌株相比均具有显著性差异。

2.4 遗传稳定性的测定

将米曲霉8421和8422传代6次并发酵后测定其总蛋白酶活和TCA可溶性蛋白含量，结果见图3。

由图3中可以看出，菌株编号8421和8422经过6次传代实验后，酶活和TCA可溶性蛋白含量均处于相对稳定的状态，可见诱变后两菌株遗传稳定性较好。

图3 菌株各代遗传稳定性Fig.3 Stability study of the mutagenic strain

3 结论

通过对米曲霉CICC40186进行紫外诱变选育，诱变时间为8min，经过初筛和复筛选育出两株所产蛋白酶活力高，对高温变性豆粕分解能力强的菌株，编号8421、8422，两菌株所产蛋白酶中酸性、中性、碱性蛋白酶较原菌株比较均有较大提高，且通过发酵，使高温变性豆粕中TCA可溶性蛋白含量分别提高了约13.0%和13.2%，两菌株遗传性状稳定。

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[2]KSVishwanatha，AG Appu Rao，Sridevi Annapurna Singh. Characterisation of acid protease expressed from Aspergillus oryzae MTCC 5341[J].Food Chemistry，2009，114：402-407.

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Screening of Aspergillus oryzae for highly denatured defatted soy flakes fermentation

ZHAO Wei-hua，CHENG Jian-jun*，YANG Qiu-ping，REN Wei-cong
（Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

The Aspergillus oryzae CICC40186 was mutagenized by the ultraviolet radiation.Based on the activity of three proteases and the content of Trichloroacetic acid（TCA）soluble protein，Aspergillus oryzae 8421 and 8422 were screened.Compared with the original strains，the acid protease，neutral protease，and alkaline protease of the mutant strains were increased by 73.2%and 91.2%；81.1%and 83.7%；37.6%and 32.9% respectively.The content of the TCA soluble protein was increased by 13.0%and 13.2%respectively.The heredity was stable after 6 generation.

Aspergillus oryzae；ultraviolet mutation；protease；TCA soluble protein

TS201.3

A

1002-0306（2012）01-0186-03

2010－11－15 *通讯联系人

赵伟华（1985-），男，研究生，研究方向：农产品加工与储藏。

黑龙江省科技计划项目任务书（GB08B401-02）。