MCM-41固定化柚苷酶脱苦葡萄柚汁

雷生姣，潘思轶，肖 敏，马少君，吕晓燕

（华中农业大学食品科学与技术学院，湖北武汉430070）

MCM-41固定化柚苷酶脱苦葡萄柚汁

雷生姣，潘思轶*，肖 敏，马少君，吕晓燕

（华中农业大学食品科学与技术学院，湖北武汉430070）

以介孔分子筛MCM-41为载体，戊二醛为交联剂，采用吸附-交联法进行了柚苷酶的固定化。研究了酶液浓度、戊二醛浓度、吸附交联时间和固定化pH对固定化效果的影响，对影响固定化效果的因素进行了分析。确定最佳的固定化条件为：酶液浓度为0.4mg/mL，戊二醛浓度2.0%，吸附交联时间为6h，固定化pH为4.0（醋酸缓冲液）。采用海藻酸钠和聚乙烯醇对制备的固定化酶进行二次包埋处理，并应用于葡萄柚汁的脱苦。结果显示，游离酶和MCM-41固定化酶对果汁的脱苦率分别为96.65%和92.90%，海藻酸钠和聚乙烯醇二次固定化的柚苷酶脱苦率分别为72.64%和70.90%。脱苦后的果汁营养成分与理化指标均有一定程度降低。为柚苷酶的固定化提供了一种新型的载体材料，为固定化柚苷酶在果汁脱苦中的工业化应用提供了理论基础。

柚苷酶，MCM-41，固定化，脱苦，葡萄柚

柚皮苷（Naringin）是柑橘类果汁中主要的苦味物质之一，是一种二氢黄酮类化合物，是黄酮类化合物的主要代表物之一，主要存在于芸香科植物（Pummelo，Citrus grandis）、葡萄柚（Grapefruit）、酸橙（Sour orange）及其变种的果皮和果实中[1]，其化学名为柚皮素-7-β-D-葡萄糖（2→l）-α-L-鼠李糖。柚苷酶（EC3.2.1.40）主要来源于曲霉属和青霉属，具有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的活性，在pH4.0时具有较高的活性[2]。它其中的α-L-鼠李糖苷酶能将柚皮苷水解为鼠李糖和普鲁宁（苦味约为柚皮苷的1/3）；普鲁宁在β-D-葡萄糖苷酶的作用下又能被水解成柚皮素（无苦味）和葡萄糖。葡萄柚属柑橘属（Citrus），又称为西柚，是广受欢迎的一类水果。葡萄柚汁经存放或加热处理后会产生令人难以接受的苦味，影响产品的品质和价值，因此葡萄柚汁必须进行脱苦处理。脱除果汁苦味物质的方法主要有利用吸附剂脱苦[3-4]、膜过滤[5]、离子交换树脂脱苦[6-7]和其他脱苦方法等[8-9]。生物酶法中研究较多的是固定化柚苷酶，它具有专一性强、效果好、成本低等优点；而且柚皮素具有许多类似于柚皮苷的生物活性[10]，对人类健康有益。影响固定化效果的因素很多，而固定化载体是其中最重要的影响因素之一。介孔分子筛作为一种新型的无机载体材料，正日益成为生物酶固定化的宿主材料[11]。它具有纳米级规则孔道、高的比表面积和易于表面功能化等优点，表面带有弱酸性硅羟基（-SiOH），能与酶分子的氨基通过氢键、范德华力、静电力等弱相互作用而将其固定于分子筛表面。MCM-41介孔分子筛是研究较多的固定化载体，它具有六方有序规则排列的一维孔道，比表面积可达1000m2/g，孔容平均为0.7～1.2cm3/g。目前已有报道将细胞色素[12]、木瓜蛋白酶[13]、胰蛋白酶[14]、维生素[15]、肌红蛋白[16]和脂肪酶[17]等固定在其上，但未见柚苷酶固定在其上的报道。本文以介孔分子筛MCM-41为载体，戊二醛为交联剂，制备了性质稳定的粉末状固定化柚苷酶。制备的固定化酶应用于葡萄柚汁脱苦时，由于其为粉末状，操作繁琐，因而结合海藻酸钠和聚乙烯醇易于成型、具有良好的生物相容性、来源广泛以及无毒副作用等优点，通过二次固定化制备了固定化酶凝珠。同时，比较了三种不同方法制备的固定化酶对葡萄柚汁的脱苦效果，为固定化柚苷酶的工业化应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葡萄柚 湖北松滋望春花食品有限公司；柚苷酶（CAS号：9068-31-9） Sigma-Aldrich公司，活力369U/g；柚皮苷 Sigma-Aldrich公司，HLPC 98%；柠檬苦素、柚皮素 成都普思生物科技有限公司，HLPC 98%；介孔分子筛MCM-41 上海卓悦化工科技有限公司；海藻酸钠（SA） 上海化学试剂分装厂，化学纯；聚乙烯醇（PVA），（1750±50）u、一缩二乙二醇（DEG）、25%戊二醛 国药集团化学试剂有限公司，分析纯；乙腈美国TEDIA公司，色谱纯。

高效液相色谱仪 配有可变波长紫外检测器和Millennium 32色谱工作站，美国WATERS公司；分析天平AR5120 梅特勒-托利多仪器有限公司；低温高速离心机 Avanti J-E型，美国Beckman Coulter公司；双功能水浴恒温振荡器 金坛市杰瑞尔电器有限公司；pH计 SARTORIUS AG公司；折光仪 上海测维光电技术有限公司；HHS-6型恒温水浴锅 国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 葡萄柚汁的制备 葡萄柚人工去皮后，用榨汁机进行榨汁，榨取的葡萄柚汁-14℃冷藏。将冷藏过的葡萄柚汁在室温下自然解冻，在4200r/min下离心15min，得葡萄柚原果汁。

1.2.2 固定化柚苷酶的制备

1.2.2.1 介孔分子筛MCM-41固定化柚苷酶 10mL的离心管中称取0.01g介孔分子筛MCM-41，加入1.0mL用0.2mol/L的醋酸缓冲液（pH4.0）配制的0.4mg/mL的柚苷酶溶液和0.08mL 25%的戊二醛（占总体积2%），置于15℃的恒温振荡器（150r/min）中吸附6h，低温离心机（4200r/min）中离心15min，弃去上清液，再用2.0mL的0.2mol/L的醋酸缓冲液（pH4.0）洗涤、离心，连续进行三次，即制得MCM-41固定化柚苷酶湿样，储藏于4℃冰箱中备用。

1.2.2.2 海藻酸钠（SA）-MCM41固定化柚苷酶 按

1.2.2.1 的方法制备0.5g MCM-41固定化酶，与100g 3%的海藻酸钠溶液充分混匀，用5mL注射器匀速滴入4%CaCl2溶液中，固化1h，蒸馏水润洗3次，即可制得3～5mm的固定化柚苷酶凝珠，吸水纸吸干后冰箱中储藏备用。

1.2.2.3 聚乙烯醇（PVA）-MCM41固定化柚苷酶 按1.2.2.1的方法制备0.5g MCM-41固定化酶，与100g 9%的聚乙烯醇和1%的海藻酸钠混合溶液充分混匀，用5mL注射器匀速滴入4%硼酸和1%CaCl2溶液中固化2h，蒸馏水润洗3次，即可制得3～5mm的固定化柚苷酶凝珠，吸水纸吸干后冰箱中储藏备用。

1.2.3 固定化柚苷酶脱苦葡萄柚汁 含2.0mg柚苷酶的MCM-41、SA-MCM41和PVA-MCM41固定化酶分别加入20mL葡萄柚汁中，充分密封混合，置于60℃恒温水浴锅中反应30min，再立即于100℃沸水浴中灭酶活5min，酶解后的果汁自然冷却后用于测定苦味物质的含量和理化指标。

1.3 测定方法

1.3.1 柚苷酶活力的测定 固定化酶活力测定：改进的Davis’[18]法测定反应液中柚皮苷的含量；1.0mL反应体系中（0.2mol/L醋酸缓冲液，pH4.0）含0.1mg柚苷酶和0.6mL底物柚皮苷（500μg/mL），60℃的恒温振荡器（150r/min）中精确反应30min后，添加4.9mL 90% DEG和4.0mol/L NaOH 0.1mL，充分摇匀，在40℃水浴锅中保温发色10min；取出注入1cm比色皿内，用紫外分光光度计在420nm处测定吸光值，通过柚皮苷标准曲线计算酶活力。

以0～250μg/mL柚皮苷为标准溶液，添加90% DEG于40℃显色10min，420nm测定吸光值，以柚皮苷浓度为横坐标，吸光值为纵坐标制作标准曲线。得柚皮苷标准曲线方程为：y=0.0035x-0.0002。

相对活力（%）＝固定化酶的活力/固定化酶的最高活力×100%

1.3.2 高效液相色谱法（HPLC）测定葡萄柚汁中的苦味物质 葡萄柚汁中柚皮苷、柚皮素和柠檬苦素的测定采用HPLC法[19]。HPLC检测中流动相为A（乙腈）和B（水），流速1.0mL/min，检测波长280nm。C18色谱柱（4.3mm×25cm），进样量20μL，柱温25℃。流动相按下述条件进行：0～8min，23%A；8～15min，23%～65% A linear；15～20min，65%～70%A linear；20～21min，70%～ 23%A linear；21～22min，23%A。柚皮苷、柚皮素和柠檬苦素的定量采用HPLC峰面积与物质的浓度之间的关系进行计算。

1.3.3 葡萄柚汁理化指标的测定 葡萄柚汁中可溶性固形物采用手持折光仪测定（国标ISO 2173-78），pH用pH计进行测定，可溶性糖含量采用蒽酮法进行测定[20]，根据GB/T 6195-1986测定维生素C的含量和GB/T12456-1990测定总酸含量。

2 结果与分析

2.1 介孔分子筛MCM-41固定化柚苷酶工艺条件优化

2.1.1 MCM-41介孔分子筛的承载量 按1.2.2.1的方法，其他固定化条件不变，分别加入不同浓度（0.2～0.7mg/mL）的柚苷酶进行固定化吸附，假设吸附完全进行，则每克载体上承载的酶为20～70mg。按1.3.1固定化酶活力测定方法测定相对活力，实验结果如图1所示。

图1 MCM-41介孔分子筛的承载量Fig.1 Naringinase loading on MCM-41 materials

由图1可知，当载体的承载量从20mg/g载体增加到40mg/g载体时，固定化酶的相对活性迅速增加；当承载量从40mg/g载体继续增加到70mg/g载体时，固定化酶的相对活性开始随着承载量的增加而下降。这种变化规律主要与MCM-41孔道的容量有关。当介孔分子筛的孔道被酶分子所饱和时，固定化酶活性达到最大；此后继续增加酶量，过多的酶分子负载于分子筛孔道中会导致孔道堵塞，使孔道内的酶分子的活性无法表现出来，固定化酶的相对活性下降。因此，本实验选择0.4mg/mL的酶液进行固定化，即MCM-41的承载量为40mg/g载体。

2.1.2 戊二醛浓度对固定化效果的影响 按1.2.2.1的方法，其他固定化条件不变，分别加入不同体积（0.02～0.12mL）的25%的戊二醛，即戊二醛的体积比为0.5%～3.0%（占总体积），按1.3.1固定化酶活力测定方法测定相对活力，则体系中戊二醛浓度对固定化效果的影响如图2所示。

图2 戊二醛浓度对固定化酶相对活力的影响Fig.2 Effect of the glutaraldehyde concentration on the relative activity of the immobilized naringinase

由图2可知，固定化过程中戊二醛浓度从0.5%添加至2.0%时，载体上固定的酶量迅速增加，表现为固定化酶的相对活力增加；当戊二醛浓度继续增加至3.0%时，固定化酶的相对活性开始缓慢下降。在酶的固定化反应中，戊二醛作为交联剂，能提供有效的醛基，使酶分子与载体更易发生交联，提高固定化效率；但是同时，戊二醛也是酶的变性剂，过量的戊二醛会引起酶的失活。综上所述，当戊二醛浓度低于2.0%时，其综合作用对酶固定化有利；当戊二醛浓度高于2.0%时，其综合作用不利于酶的固定化。因此，本实验中确定戊二醛浓度为2.0%。

2.1.3 pH对固定化效果的影响 按1.2.2.1的方法，其他固定化条件不变，改变缓冲体系的pH，按1.3.1固定化酶活力测定方法测定相对活力，则介孔分子筛MCM-41固定化柚苷酶的适宜pH如图3所示。

图3 pH对固定化酶相对活力的影响Fig.3 Effect of pH on the relative activity of the immobilized naringinase

由图3可知，固定化反应过程中pH从2.5提高至4.0时，固定化酶的相对活力迅速由63.41%提高至最大值；当pH超过4.0时，固定化酶的相对活力则呈下降趋势。在介孔分子筛固定化酶的过程中，酶分子主要是通过与载体表面的羟基形成氢键的方式吸附在载体表面上，因而材料表面的带电性质和酶分子的带电性质就决定了两者之间作用力的大小，而pH影响了两者的带电情况。根据Takahashi[21]的研究，介孔分子筛MCM-41表面硅羟基具有较强的阴离子电势，倾向于吸附阳离子，即材料表面有利于吸附带正电荷残基的酶，即在酸性范围固定化效果较好。柚苷酶固定在MCM-41上，pH4.0时相对活力最大，说明此条件下两者作用力最强。此外，酶分子通过戊二醛与载体之间的交联在pH4.0时也可能最稳定。因此，本实验确定MCM-41固定化柚苷酶体系的pH为4.0。

2.1.4 酶吸附-交联时间对固定化效果的影响 按

1.2.2.1 的方法，其他固定化条件不变，改变固定化酶的吸附时间后制备固定化酶，按1.3.1固定化酶活力测定方法测定相对活力，结果如图4所示。

图4 吸附-交联时间对固定化酶相对活力的影响Fig.4 Effect of absorb-crosslinking time on the relative activity of the immobilized naringinase

介孔分子筛表面及内部为多孔有序结构，分子在载体内部的扩散反应需要一定时间。由图4可知，固定化反应时间在1～6h内，随着固定化时间的延长，酶的相对活力也随之增加；固定化反应达到6h时，固定在载体上的酶量达到最大值，相对活力最高；但超过6h后，随着时间的延长，酶的相对活力迅速下降。这是因为如果固定化时间太长，更多酶分子的进入引起孔道堵塞，使孔道内的酶分子不能表现其活性。此外时间越长，戊二醛导致的失活酶分子也越多，这也是引起固定化酶相对活性下降的原因之一。因此，本实验固定化酶的最佳吸附交联时间为6h。

在优化条件下制备的MCM41固定化酶的活力回收率可达90%左右。

2.2 紫外检测波长的选择与确定

取适当浓度的柚皮苷、柚皮素和柠檬苦素标准品，在HPLC测定中，于200～400nm处进行紫外扫描，结合流动相对分析的影响，确定最适波长，结果如图5所示。

结果表明，柚皮苷在282.9nm有最大吸收值，柚皮素在288.8nm有最大吸收，柠檬苦素在223.7nm有最大吸收值。综合考虑，确定物质的吸收波长为283nm。

图5 柚皮苷、柚皮素和柠檬苦素标准品的紫外扫描图谱Fig.5 UV profiles of standard naringin,naringenin and liminon

2.3 苦味物的标准曲线的制定

图6为柚皮苷、柚皮素和柠檬苦素标准品和葡萄柚汁的HPLC图谱。由图6a可知，柚皮苷、柚皮素和柠檬苦素标准品的出峰时间分别为8.029、16.018、18.038min。由图6b和c可以看出，葡萄柚汁酶解前后的物质出峰时间稳定，与标准品基本一致，说明HPLC中采用的流动相能应用于以上三种物质的含量测定。

以HPLC测定结果中标准品的峰面积为纵坐标，各物质的浓度为横坐标作图，得到相应标准品的曲线方程分别为：y柚皮苷=15551x-7533，y柚皮素= 31452x+10612，y柠檬苦素=2504x-1302；其相对应的相关系数分别为0.9998、0.9933和0.9993。

2.4 固定化柚苷酶对葡萄柚汁的脱苦

表1为葡萄柚汁酶解前后柚皮苷、柚皮素和柠檬苦素的含量比较，其中脱苦率为酶解后果汁中的柚皮苷与原果汁中的柚皮苷含量之比，用百分数表示。由表可知，游离柚苷酶和MCM-41固定化柚苷酶对果汁的脱苦效果较好，产生的柚皮素较多；SA-MCM41柚苷酶和PVA-MCM41柚苷酶对果汁的脱苦效果相对较低，产生的柚皮素也较少；而且它们对果汁中的柠檬苦素影响均较小。这主要是因为SA和PVA凝珠均为网络大孔状结构，底物在其的扩散与反应均需要一定的时间，同时网络结构对底物与产物还存在一定的束缚作用，影响了酶解反应的进一步进行，因此与游离酶和粉末状的MCM-41固定化酶相比，脱苦效果会降低，产生的柚皮素也相应减少。

以SA和PVA对MCM41-naringinase进行二次固定化后，尽管对葡萄柚汁的脱苦效果有所降低，但由于二次固定化后，柚苷酶能被重复应用于果汁脱苦，且凝珠易于与产品进行分离，操作简便，节约了工业化应用中的成本，因而具有较强的实用价值。

图6 HPLC图谱：柚皮苷、柚皮素和柠檬苦素标准品（a），原葡萄柚汁（b），MCM-41固定化酶酶解的葡萄柚汁（c）Fig.6 HPLC profiles of standard naringin,naringinin and liminon（a），and raw grapefruit juice（b）and after hydrolyzed by MCM-41 naringinase（c）

表1 葡萄柚汁酶解前后苦味物的比较Table 1 The bitter compound of grapefruit juice before and after debittering

2.5 葡萄柚汁脱苦前与脱苦后的理化指标比较

采用酶法脱除葡萄柚汁中的苦味物质柚皮苷，使得果汁风味更佳，更适合普通消费者的饮用习惯，然而脱苦后果汁中的营养成分会有一些损失，因此有必要在脱苦后检测果汁中营养成分的变化。葡萄柚汁经柚苷酶脱苦前后的营养成分与理化指标的测定结果见表2。由于果汁脱苦后，于100℃沸水中处理过，因此营养成分维生素C在酶解液中含量很少，可在后续加工过程中进行补充；其它指标，如可溶性固形物、pH、总酸以及总糖含量均有下降。

表2 葡萄柚汁酶解前后理化指标的比较Table 2 The characteristics of grapefruit juice before and after debittering

3 结论

与其它酶固定化载体相比，介孔材料是一种新型的环境友好型多孔材料，其大的比表面积和分布均匀的孔道结构可使其用于酶的固定化。海藻酸钠和聚乙烯醇是应用最为广泛的固定化酶载体。介孔分子筛有序的空间孔道结构为酶的固定化提供了一个天然的微环境，减少了酶的变性；同时，二次固定化又有效地防止了酶在介孔材料表面的泄露，提高了固定化酶的应用前景。研究结果表明，柚苷酶可通过吸附-交联法固定于介孔分子筛MCM-41孔道中，在适宜的固定化条件下，载体的承载量可达40mg/g载体，优于其它类的载体，而且制备的固定化酶性质稳定，酶活力回收率高。因此，以介孔分子筛MCM-41作为载体，为柚苷酶的固定化提供了一种新型的载体材料，有利于解决柚苷酶实际应用中的限制问题。

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Naringinase immobilized on MCM-41 to debitter grapefruit juice

LEI Sheng-jiao，PAN Si-yi*，XIAO Min，MA Shao-jun，LV Xiao-yan
（College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

The mesoporous molecular sieve MCM-41 was employed as a support to immobilize naringinase. And adsorption method and crosslinked with the bifunctional agent glutaraldehyde（GA）were adopted to improve enzyme loading.The effects of naringinase and GA concentration，immobilization time and pH on the activity of immobilized naringianse were investigated.The main factors which influenced the immobilization process and properties of the immobilized enzyme also were analyzed and discussed.The optimum conditions for immobilization of naringinase were as follows：naringianse and GA concentration were 0.4mg/mL and 2.0% respectively，and the immobilization time of 6h in pH 4.0（acetate buffer）.Sodium alginate（SA）and polyvinyl alcohol（PVA）were used to embed the immobilized MCM41-naringinase secondly and apply to debitter grapefruit juice.The results showed that debittering rate of the free and immobilized MCM41-narnginase were 96.65%and 92.90%，and embedded naringinase secondly with SA and PVA were 72.64%and 70.90%，respectively.The nutrition and physical characteristics of the grapefruit juice after debittered were decreased to some extent.A new matrix material to immobilize naringinase and provided the theoretical basis for its industrial applications in debitter juice.

naringinase；MCM-41；immobilization；debittering；grape fruit

TS255.1

A

1002-0306（2012）01-0189-05

2010－11－03 *通讯联系人

雷生姣（1975-），女，博士研究生，研究方向：粮食、油脂与植物蛋白工程。