腌制酸菜中亚硝酸盐降解菌的筛选及其降解特性研究

高小朋，苏 青，程同培

（延安大学生命科学学院，陕西延安716000）

腌制酸菜中亚硝酸盐降解菌的筛选及其降解特性研究

高小朋，苏 青，程同培

（延安大学生命科学学院，陕西延安716000）

通过划线分离、格里斯试剂比色法、紫外分光光度法测定，从陕北地区的酸菜水中筛选得到11株亚硝酸盐降解菌，经过测定，菌株SQ-4可以高效降解亚硝酸盐，降解率可达97.60%。通过检测硝酸盐和VC含量可知，该菌株并未通过代谢活动将亚硝酸盐转化为硝酸盐，同时产生了一定量的VC。

亚硝酸盐，降解，菌株，VC

有研究表明，长期食用自制酸菜会导致食道癌和胃癌的发生，其原因主要是酸菜腌制过程中产生大量的亚硝酸盐，使酸菜中的亚硝酸盐含量超标[1]，过量的亚硝酸盐能够与胃内食物中的仲胺类物质相互作用，转化为亚硝胺而引发癌症[2]，更为严重的是，食入0.3～0.5g亚硝酸盐即可引起中毒甚至死亡[3-5]。陕北地区人民有常年食用自制酸菜的习惯，本实验从陕北地区长期腌制酸菜的酸菜水中筛选出可以降解亚硝酸盐的菌株，对酸菜中的亚硝酸盐进行降解，并对实验菌株改变酸菜的风味、提高营养进行了探讨，以期为减少该地区因长期食用自制酸菜而引发的食道癌和胃癌的发生和生产腌制食品中降低亚硝酸盐含量的研究提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试水样 延安宝塔区、榆林佳县等地腌制酸菜的酸菜水；培养基 筛选培养基[6]、LB培养基[7]；对氨基苯磺酸、N-1-萘基乙二胺、2，6-二氯酚靛酚、Ag2SO4均为分析纯。

隔水式电热恒温培养箱 PYX-DHS-40*50-BS，上海跃进医疗器械厂；紫外分光光度计 UVmini-1240，日本岛津；立式压力蒸汽灭菌锅 LS-B50L，江阴滨江医疗仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 亚硝酸盐降解菌的筛选

1.2.1.1 初筛 无菌操作将取得的酸菜水水样在筛选培养基平板上划线分离，挑取单菌落，多次重复，将纯化得到的菌株于（4±1）℃冰箱保存备用。

1.2.1.2 复筛 将初筛得到的菌株利用格里斯试剂比色法[8]检测菌株对亚硝酸盐的降解情况，选择降解率较高的菌株作为下一步的实验菌株。

1.2.2 实验菌株降解亚硝酸盐能力的检测

1.2.2.1 亚硝酸盐标准曲线的绘制 参照文献[6]。

1.2.2.2 培养液中亚硝酸盐含量的测定 取20mg/mL NaNO2溶液1mL加入到100mL筛选培养基中（培养液中NaNO2浓度为200mg/L），各实验组加入复筛得到的菌株培养液5%，另取一组不加菌液作为空白对照，（35±1）℃静置培养7d，每隔24h各取适量培养液，8000r/min离心15min，取一定量上清，按白雪娟等[8]的方法，测定各样品的OD550，根据1.2.2.1绘制的NaNO2标准曲线可计算出各组样品中NaNO2的残留量。

1.2.2.3 亚硝酸盐降解率的测定 根据以下公式可计算出不同实验菌株对NaNO2的降解率：

式中：X0—不同培养时刻空白组样品中NaNO2含量；X1—不同培养时刻实验组样品中NaNO2残留量。

根据各实验菌株不同培养时刻的降解率，选出降解率最高的一株为本研究的目的菌株，同时，绘制目的菌株对亚硝酸盐的降解曲线。

1.2.3 亚硝酸盐去向的研究 培养液中的亚硝酸盐减少后，可能被实验菌株吸收利用，也可能被氧化为硝酸盐，为了得知亚硝酸盐的去向，在培养不同时刻测定亚硝酸盐的同时，还需测定培养液中硝酸盐的含量。

取1.2.2.2中第一步得到的滤液10mL，采用锌粒还原法[9]测定培养液中硝酸盐含量，根据NaNO2标准曲线计算滤液中还原后NaNO2总的含量，根据以下公式计算滤液中NaNO3含量：

X=（XB-XA）×1.232

式中：XA—不同培养时刻样品中NaNO2含量；XB—不同培养时刻样品中经还原后NaNO2总含量；X—试样中NaNO3含量。

以时间为横坐标，以NaNO3含量为纵坐标，绘制培养液中NaNO3含量变化曲线。

1.2.4 实验菌株降解亚硝酸盐产生维生素C的研究 实验菌株不仅要降低酸菜水中亚硝酸盐的含量，还要能增加酸菜的营养，主要研究了酸菜水中维生素C的变化情况，维生素C含量测定采用2，6-二氯酚靛酚滴定法[10]，以时间为横坐标、以维生素C含量为纵坐标，绘制不同培养时刻维生素C的含量曲线。

2 结果与分析

2.1 亚硝酸盐降解菌的筛选结果

将取得的酸菜水水样在筛选培养基固体平板上多次划线分离后，得到22株菌，利用格里斯试剂比色法[8]初步筛选出具有降解亚硝酸盐能力的实验菌株11株，分别编号为SQ-1、SQ-2、SQ-3、SQ-4、SQ-5、SQ-6、SQ-7、SQ-8、SQ-9、SQ-10、SQ-11。

2.2 实验菌株降解亚硝酸盐能力的测定结果

2.2.1 亚硝酸盐标准曲线的绘制 采用1.2.2.1的方法，绘制出的亚硝酸钠标准曲线如图1。

图1 NaNO2标准曲线Fig.1 Standard curve of NaNO2

由绘制所得的标准曲线方程为y=0.4772x+0.0052，相关系数R2=0.9984，拟合度较好，可以用于后续实验中的样品测定。

2.2.2 实验菌株降解亚硝酸盐能力的测定结果 根据1.2.2.2和1.2.2.3的测定方法，各实验菌株培养7d时对NaNO2的降解情况如图2。

由图2可知，11株实验菌株除SQ-7外，其他菌株都对NaNO2有较高的降解率，其中SQ-4、SQ-5、SQ-9、SQ-10降解率都达到了80%以上，SQ-4降解率最高，达到了97.6%，因此，选择SQ-4作为此次研究的目的菌株，以培养时间为横坐标，以OD550为纵坐标，绘制出菌株SQ-4在不同培养时刻对NaNO2降解曲线如图3。

图2 各实验菌株对NaNO2的降解率Fig.2 The degradation rates of strains to NaNO2

图3 菌株SQ-4对NaNO2的降解曲线Fig.3 Degradation curve of SQ-4 to NaNO2

由图3可知，在开始0～5d，培养液中NaNO2含量急剧降低，第5d后趋于平缓，并且在第7d NaNO2几乎全部消失，其降解率可达97.60%；而未加菌的对照组NaNO2含量略有下降，这可能是由于空气中的氧将部分NaNO2氧化所致。

2.3 亚硝酸盐去向的研究结果

培养液中的NaNO2含量明显降低，可能被实验菌株吸收利用，也可能被氧化为硝酸盐，经过测定，不同培养时刻培养液中NaNO2和NaNO3含量变化情况如图4。

图4 NaNO2和NaNO3含量变化曲线Fig.4 The content change of NaNO2and NaNO3

由图4可知，在培养过程中，NaNO2含量明显下降，而NaNO3却没有明显变化，由此可知，减少的NaNO2并没有被转化为NaNO3，可能转化为其他物质或是被SQ-4在生长过程中利用转化为自身的物质。

2.4 菌株SQ-4产维生素C的研究

采用2，6-二氯酚靛酚滴定法测定不同培养时刻培养液中的VC的含量，以培养时间为横坐标，以VC的含量为纵坐标，得到VC含量变化情况如图5。

图5 SQ-4产VC曲线Fig.5 The content curve of VCproduced by SQ-4

由图5可知，菌株SQ-4在利用NaNO2的过程中，能够产生VC，并且其含量随培养时间的延长而增加，这有助于增加酸菜的营养，改善酸菜的风味。

3 结论

3.1 本实验经过筛选得到11株对亚硝酸盐具有降解能力的菌株，通过测定得知，菌株SQ-4在培养0～5d时，亚硝酸盐迅速下降，7d时亚硝酸盐含量降至最低，降解率高达97.60%。

3.2 通过还原法测定培养液中硝酸盐含量，可知实验菌株在降低亚硝酸盐的过程中，并没有将亚硝酸盐氧化为硝酸盐，而是将亚硝酸盐吸收利用转化为菌体自身的物质或者转化为其他物质。

3.3 实验菌株在利用亚硝酸盐的过程中，可以产生维生素C，而且维生素C的含量随培养时间的延长而增加，由此可知，菌株SQ-4不仅可以降低酸菜水中的亚硝酸盐，而且还可以实现改善酸菜风味，增加营养的功效。

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[2]惠永倩.强化学致癌物—N-亚硝基化合物[J].人民军医，1982，15（1）：25-27.

[3]丁之恩.亚硝酸盐与亚硝胺在食品中的作用及其机理[J].安徽农业大学学报，1994，19（2）：199-205.

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[7]周德庆.微生物学实验教程[M].第二版.北京：高等教育出版社，2006：372.

[8]白雪娟，徐世众.格里斯试剂比色法测定肉制品中亚硝酸盐含量[J].肉类工业，2008（7）：46-47.

[9]肖义夫，廖百森，赵舰，等.锌粒还原法快速测定食品中的硝酸盐[J].中国食品卫生杂志，2003，15（4）：316.

[10]王秀奇.基础生物化学实验[M].北京：高等教育出版社，2005：195-199.

Study on isolation of one bacterial strain capable of nitrite degeneration from traditional pickled vegetable and its characteristics

GAO Xiao-peng，SU Qing，CHENG Tong-pei
（College of Life Science，Yan’an University，Yan’an 716000，China）

Eleven strains which could degradate nitrite were isolated from sour pickled cabbage water from northern region of Shaanxi.The degradation rate of strian SQ-4 was 97.60%，after detection，result showed the nitrite couldn’t be oxidated to nitrate by strian SQ-4 and produced Vitamin C in the process.

nitrite；degradation；stains；Vitamin C

TS201.1

A

1002-0306（2012）01-0198-03

2011－01－14

高小朋（1976-），男，讲师，研究方向：资源与环境微生物学。