木质纤维素酸水解液的脱毒方法研究

马英辉，李利军，王联结，卢美欢

（1.陕西省微生物研究所，陕西西安710043；2.陕西科技大学，陕西西安710021）

木质纤维素酸水解液的脱毒方法研究

马英辉1，李利军1，王联结2，卢美欢1

（1.陕西省微生物研究所，陕西西安710043；2.陕西科技大学，陕西西安710021）

由于木质纤维素的酸水解条件剧烈，水解液中必定存在影响微生物生长和发酵的物质，特别是多酚类化合物，需对水解液进行脱毒处理。通过探讨8种脱毒方法对还原糖损失率和酚类脱出率的影响，研究发现，树脂XDA-1+ CaCO3，脱除酚类效果最好，还原糖损失率较低，并通过生物性检验也表现了良好的效果。

木质纤维素，发酵抑制物，脱毒方法

虽然利用稀酸水解木质纤维素，还原糖得率较高，但由于水解条件的剧烈程度使得水解液中还含有乙酸、糠醛以及木素的酸解产物（多羟基芳香化合物）等所谓的发酵抑制剂[1]，所以在水解液进行酒精发酵之前必须对其进行脱毒处理，尽量降低这些抑制物的浓度，以改善水解液发酵性能，提高产品的得率。对于乙酸和糠醛，在水解糖液浓缩时，可以借助旋转蒸发将其脱出[2]，但同时增大了多酚类毒性物质的浓度，所以在浓缩前将其中的酚类物质除去并且保证糖的损失率降到最低是关系到水解液发酵性能的关键。本文通过物理、化学、生物方法分别对水解液进行脱除酚类处理并对其进行了生物性检验。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

嗜单宁管囊酵母（Pachysolen tannophilus 1771）购于中国菌种保藏中心；秸秆纤维素酸水解液 用稀磷酸水解所得；浓盐酸，硫酸锂，碳酸钠-酒石酸钠，丹宁-木质素试剂，漆酶（1000LAMU/g），树脂（XDA-7、XDA-1、D301）。

倒置成像显微镜（XDS-1B），层析柱，恒流泵。

1.2 实验方法

1.2.1 树脂活化再生方法 按照参考文献[3]。

1.2.2 脱毒方法 a.用Ca（OH）2粉末将水解液中和至溶液pH=10.0，然后再用硫酸将pH调整为4.5，在1702N的离心力下离心15min，残渣回收，取上清液为脱毒液A。

b.用CaCO3粉末将水解液中和至中性，再用硫酸将pH调整为4.5，在1702N的离心力下离心15min，残渣回收，取上清液为脱毒液B。

c.将水解液用氨水中和至pH=5.0，按照液固比为10∶1（mL/g）加入活性炭，在25℃、100r/min搅拌1h，在1702N的离心力下离心15min，残渣水洗烘干可重复利用，上清液为脱毒液C。

d.将水解液用氨水中和至pH=2.0，加入水解液1/3体积的乙酸乙酯，搅拌30min，静置30min后，取下层液体为脱毒液D。

e.将水解液用氨水中和至pH=4.0，然后按8LAMU/mL加入漆酶，在50℃、120r/min进行酶解处理，得脱毒液E，每隔4h取样测定酚类化合物的脱出率。

f.将活化后的XDA-7树脂以5∶1（v/w）液固比与水解液混合于300mL三角瓶中密封，在室温（24℃）下，120r/min摇床作静态吸附，12h测定吸附后溶液的木糖浓度和多酚化合物浓度。此溶液为脱毒液F。

g.将活化后的D301树脂按照f相同的操作得脱毒液G。

h.XDA－1号树脂活化后按照f相同的操作得脱毒液H。

1.2.3 生物学检验方法 将木质纤维素水解液通过多酚脱除效果较好的XDA－1树脂，随后采用还原糖损失率较低的CaCO3中和方法进行脱酚后水解液的中和，中和后调整糖浓度为15%，并加入3%的玉米胚粉，灭菌后按10%的接种量接入已活化好的嗜单宁管囊酵母，30℃，80r/min摇床培养30h后，利用倒置成像显微镜观察各脱毒液酵母的生长情况，并计数，以考察XDA－7+CaCO3的脱毒效果。并以木糖培养液、XDA－7+CaCO3处理后的水解液、XDA－1+KOH处理后的水解液、Ca（OH）2过中和处理后的水解液和KOH中和处理后的水解液作为对比。

1.2.4 检测分析方法 还原糖测定按参考文献[4]；多羟基芳香化合物的测定按参考文献[5]；生物学检验方法（观察嗜单宁管囊酵母在脱毒液中的生长情况并计数）。

2 结果与分析

2.1 各种脱毒方法的处理结果

表1 各种脱毒方法的效果Table 1 The effect of various detoxification methods

从表1可以看出，对多酚类脱除的效果顺序是脱毒液H＞F＞G＞C＞E＞A＞B＞D，其中用XDA－1和XDA－7树脂是动态吸附脱酚的，脱酚率都能达到接近90%，而从还原糖的损失率顺序来看，E＜B＜H＜D＜A＜G＜F＜C，用CaCO3处理、XDA－1处理、乙酸乙酯萃取和漆酶处理，对还原糖的损失都不是很大，漆酶处理是一种生物处理方法，对还原糖的损失率只有4.14%，而漆酶也可以使小分子酚类化合物氧化聚合，毒性降低。据文献介绍，利用产漆酶的丝状软腐菌去除柳树半纤维素水解液中的抑制物质，能够使发酵时的最大乙醇产率提高3倍，最大可达4倍[6]。用CaCO3中和，还原糖损失率只有4.8%，但是它对酚类的脱出率只有45.13%，而根据文献，用Ca（OH）2过中和处理和D301大孔树脂吸附处理能够有效的除去酚类化合物[7]，但从本实验来看，用Ca（OH）2过中和处理后，还原糖损失率达到近30%，酚类的脱出率也仅有50%，而用D301树脂动态吸附后，酚类脱除率最高可达84.4%，但是还原糖损失率达29.17%。所以结合还原糖的损失和对酚类的脱除效果，选择XDA－1树脂动态吸附酚类后，流出液再用CaCO3中和的方法对水解液进行脱毒处理为最佳。

2.2 生物检验

2.2.1 嗜单宁管囊酵母在纤维素水解脱毒液中生长30h后的情况（稀释104倍） 从图1中a、b可以看出，用XDA－1动态吸附后再用CaCO3中和所得的水解脱毒液经过真空浓缩培养酵母，生长情况与纯糖培养基本上没有差别，酵母生长健壮，并出现出芽生殖现象。说明此脱毒方法有效地去除了影响酵母生长的抑制因子，对酵母生长的调整期并没有很大的影响。

从图1－c可以看出，酵母生长缓慢，个体较小，生长极不均匀，出芽率相对较低，并出现少部分裂解，存在明显的调整期延长现象，说明XDA－7树脂的脱酚能力亚于XDA－1树脂。

从图1－d中可以看出，同样的稀释倍数，而图中视野内酵母细胞数量较少，并且处于生长停滞状态，未见酵母芽体的出现，说明培养液中存在大量的磷酸根离子和K+造成细胞渗透压过大，影响了酵母的生长。

从图1－e中可以看出，用Ca（OH）2过中和处理的秸秆水解液，酵母细胞的生长性要优于d和f，但相对于用XDA－1树脂处理的水解液还有一定的差距，而且用Ca（OH）2过中和处理对糖的损失率比较高，酚类的脱除也未达到促进菌种旺盛生长的要求，因而酵母虽有一定的出芽率，但仍不能达到后续发酵的要求。

从图1－f中可以看出KOH处理的水解液接入酵母后，酵母生长状况最差，酵母基本没有生长的迹象，因为用KOH中和，溶液中存在高浓度木质素的降解产物，另外还有高浓度的磷酸根离子和K+对酵母的生长都造成了严重的影响。

图1 不同脱毒方法对酵母生长的影响（100×）Fig.1 The effect on the Pachysolen tannophilus cell with different detoxification methods

2.2.2 秸秆脱毒水解液中单位体积酵母菌数对比 从表2可以看出，只有XDA-1+CaCO3处理的秸秆水解液对嗜单宁管囊酵母的毒性最小，与纯的糖培养基相似，说明经过XDA-1+CaCO3后再经真空浓缩处理，确实能够解除羧酸、呋喃衍生物以及酚类化合物对酵母的抑制作用，但并不是脱毒后的水解液中不存在这些物质，而是通过降低某类物质的浓度来解除了多种抑制剂之间的协同抑制作用，而单一的抑制剂对酵母的生长抑制作用在低浓度下要远远低于协同抑制作用。但是对于多羟基芳香化合物，在低浓度下，即使mg/L级就可以明显抑制酵母生长和后续的乙醇发酵[8]，所以对于单一关键物质的脱除是解除单一抑制和协同抑制的重要途径。从表1、表2可知，XDA-1动态吸附是脱除酚类最好的方法，这样不但能够回收部分酚类物质，还达到了脱毒的目的；而其他方法处理后并未能改善酵母的生长情况，根据图1，选择XDA-1作为脱除酚类的最佳方法，结合采用CaCO3中和处理可以显著提高秸秆水解液酵母的生长性和后续糖的可发酵性。

表2 培养30h后各种脱毒水解液中酵母菌生长量对比Table 2 Contrast the growth degree of yeast in different virus-free medium for 30h

3 结论与讨论

酸法作为水解木质纤维素的一种常用方法，在生产中已得到应用，但是由于水解后水解液中发酵抑制物的存在，在很大程度上降低了发酵的效率，成为了限制酸法水解木质纤维素广泛应用的重要因素。本文采用了各种脱毒方法对纤维素稀酸水解液进行脱毒处理，结果发现，树脂XDA-1+CaCO3脱除酚类效果最好，还原糖损失率较低，并通过生物性检验也表现了良好的效果，具有较好的前景，但成本问题有待于进一步研究。随着生物技术和化工工程的不断发展，利用基因工程与分子生物学手段构建或筛选出对发酵抑制剂具有一定抗性的菌株以及寻求低成本、高效率、对后续发酵影响小的木质纤维素处理方法是今后研究的重点。

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Research on detoxification method of lignocellulose acid hydrolysate

MA Ying-hui1，LI Li-jun1，WANG Lian-jie2，LU Mei-huan1
（1.Shaanxi Province Institute of Microbiology，Xi’an 710043，China；2.Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an 710021，China）

As acid hydrolysis of lignocellulose was violent，the hydrolysates containes some compounds such as polyphenol which retarded the growth and fermentation of microorganisms.Therefore detoxification was needed. Eight kinds of detoxification methods were developed to study on xylose loss rate and the extrusion rate of phenols.The results showed that resin XDA-1+CaCO3was the best method for higher removal rate and lower xylose loss rate，and biological tests also showed good results.

lignocellulose；fermentative inhibitors；detoxification method

TS201.2+3

B

1002-0306（2012）01-0214-03

2011－01－13

马英辉（1984-），男，研究方向：木质纤维素燃料乙醇与微生物技术。