高纯度低聚半乳糖单一组分的制备研究

韩晓丽，苏芳云，冯咏梅，常秀莲，张瑞伦，刘庚鑫

（1.烟台大学化学生物理工学院，山东烟台264005；2.兰州石化公司研究院，甘肃兰州730060）

高纯度低聚半乳糖单一组分的制备研究

韩晓丽1，苏芳云2，冯咏梅1，常秀莲1，张瑞伦1，刘庚鑫1

（1.烟台大学化学生物理工学院，山东烟台264005；2.兰州石化公司研究院，甘肃兰州730060）

采用聚丙烯酰胺凝胶Bio-Gel P-2柱对低聚半乳糖混合物进行分离纯化，考察了柱温、洗脱流速和进料量对分离的影响。结果表明，采用1.6cm×120cm凝胶柱，脱气蒸馏水为洗脱剂，最佳操作条件为：柱温度50℃，洗脱流速15～20mL/h，进料量3mL。此条件下，可以制备纯度85%左右的三糖、四糖和五糖粗品，将一次分离产品浓缩后二次分离，得到纯度98%以上的三糖、四糖和五糖单一组分，收率分别为95.5%、74.4%和96.7%，达到了标准品的纯度要求。

聚丙烯酰胺凝胶，Bio-Gel P-2，低聚半乳糖，柱层析

低聚半乳糖（GOS）是以乳糖为底物，在半乳糖苷酶的作用下合成的含有3～5个单糖分子的低聚糖，具有促进双歧杆菌增殖、矿物质的吸收、改善脂质代谢及提高人体免疫力等功能，更重要的是，GOS是母乳中的天然成分之一，这正是母乳喂养对婴儿肠内的菌群发展和炎症防御起重要作用的原因[1-2]，因此，GOS被大量应用于婴幼儿食品中。目前酶法合成GOS的收率为24%～57%[3-4]，溶液中还存在相当量的乳糖、少量葡萄糖和极少量的半乳糖。本课题组曾采用纳滤技术[5]、离子交换层析[6]及葡聚糖凝胶过滤层析技术[7]纯化GOS混合物，这些技术都能够有效地提高GOS的纯度，但产品都是三糖、四糖和五糖的混合物，而得不到单一组分，这给科研工作者研究单一糖组分的药物性能及食品功能性带来很大的困难。聚丙烯酰胺凝胶可以较好地分离低聚木糖[8]和酸性低聚糖[9]等混合物，本文尝试采用Bio-Gel P-2对GOS混合物进行分离提纯，探讨了各种因素对其分离的影响，确定了最佳的分离条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

聚丙烯酰胺凝胶Bio-Gel P-2 Bio-Rad公司；GOS混合物 由烟台华海生物制品有限公司提供，经NF-3（美国Sepro公司）纳滤膜分离纯化浓缩后，HPLC分析其质量浓度为340mg/mL，组成为葡萄糖7.12%、乳糖40.38%、GOS 52.50%。

Agilent 1200 高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；带夹套层析柱 1.6cm×120cm（体积约240mL），上海华美仪器有限公司；BSZ-160F自动部分收集器 上海精科实验仪器有限公司；DGL-2002型电热鼓风干烘箱 龙口先科仪器有限公司；SC-15数控超级恒温槽 宁波天恒仪器厂。

1.2 柱层析分离

100g Bio-Gel P-2凝胶室温下溶胀24h，倾出上层细小颗粒，抽真空脱气后自动沉降法装入1.6cm× 120cm的层析柱中，装填高度为110cm，由超级恒温水浴控制层析柱温度，由自动收集器收集洗脱液。在分离过程中，采用脱气的去离子水为流动相。

1.3 HPLC分析方法

各种糖组分的含量采用HPLC分析测定。色谱条件：G1362A示差折光检测器；Aichrom-NH2色谱柱（4.6mm×250mm）；流动相为乙腈水混合液，体积比为77∶23；流速1.0mL/min；进样量：20μL，柱温25℃。

1.4 薄层层析法

采用自制的GF硅胶薄板。展开剂为V正丁醇∶V乙醇∶V水＝5∶3∶2，显色剂：1g二苯胺，1mL苯胺，50mL丙酮和5mL 85%磷酸混合，85℃显色15min。

2 结果与讨论

2.1 操作条件对分离的影响

图1 不同温度下Bio-Gel P-2对低聚糖的分离效果Fig.1 The separation effect of Bio-Gel P-2 on GOS under different temperature

图2 温度对低聚半乳糖黏度的影响Fig.2 Effect of temperature on viscosity of GOS

2.1.1 柱温对分离的影响 GOS的热稳定性非常好，180℃下长时间加热不会发生分解[1]。取待分离的GOS混合物3mL上样，洗脱流速为15mL/h，分别在18、50、70℃下进行分离操作，洗脱液每3mL收集一管。结果发现50℃和70℃的分离效果很相似，18℃和50℃的分离效果见图1，依次流出的为五糖、四糖、三糖、乳糖和葡萄糖。

由图1可以看出，升高温度对分离有利。随着温度的升高，各种糖组分之间的选择性虽然相差不大，但高温下各种糖组分之间的分离度明显高于低温下的数据。这是因为随着温度的升高，流动相和物料的黏度都随之降低，具有更好的流动性，因而分离度明显提高。温度对低聚半乳糖混合物黏度的影响见图2。由图2可以看出，温度由18℃升至50℃时，低聚糖的黏度由7.0mPa·s快速降至2.0mPa·s，而后随温度的升高，低聚糖的黏度平缓降低，变化不大，因此，50℃和70℃下低聚糖的分离效果相差不大。

2.1.2 洗脱流速对分离的影响 由于聚丙烯酰胺凝胶Bio-Gel P-2的粒径较细，为45～90μm，因此柱压较高，要维持柱子长时间处于稳定操作状态，流动相的最大流速只能达到25mL/h，因此在柱温50℃下，比较了洗脱流速15、20、25mL/h下的分离效果，结果发现，在这种窄范围内的流速下，分离效果相差不大。与15mL/h的分离效果相比，25mL/h的分离效果稍稍逊色，薄板层析图见图3，左边两个点分别为葡萄糖和乳糖标准样，43管之前为微量的低聚六糖，43管之后依次流出的为低聚五糖、四糖、三糖、乳糖和葡萄糖。

图3 流速25mL/h下聚丙烯酰胺分离的薄板层析图Fig.3 The thin layer chromatography chart of polyacrylamide gel at 25mL/h

2.1.3 进料量对分离的影响 洗脱流速20mL/h，进料量分别为3、4.5、6mL时进行分离操作，考虑到增加进料量会影响洗脱速度，因此洗脱温度均采用70℃。将各个条件下收集的糖组分进行薄板层析，根据层析图决定低聚三糖、四糖和五糖收集的范围，将收集的各种糖组分进行HPLC分析，各种糖组分的纯度及收率见表1。

表1 进料量对低聚糖分离效果的影响（%）Table 1 The separation effect of sample volume on GOS（%）

从不同进料量的薄板层析图（图略）明显可以看出，随着进料量的增加，各种糖组分之间的分离度明显降低，特别是四糖与三糖、三糖与乳糖之间交叉的幅度增大，导致三糖的纯度和收率急剧下降（见表1）；收集的低聚四糖和五糖的纯度差别不大，但其收率明显降低。因此，本实验条件下，适宜的进料量是3mL。

2.2 低聚半乳糖单一组分的制备

在操作温度为50℃，洗脱流速为20mL/h，进料量为3mL的条件下，将聚丙烯酰胺凝胶柱层析多次分离GOS混合物得到的三糖、四糖和五糖粗品分别混匀，三糖混合物中含有乳糖、三糖和四糖，HPLC分析知其质量分数分别为4.3%、87.4%和8.3%；四糖混合物中含有三糖、四糖和五糖，其质量分数分别为12.5%、82.7%和4.8%；五糖混合物中含有四糖、五糖和少量六糖，其质量分数分别为7.9%、90.0%和2.1%，将三糖和四糖混合物浓缩至质量浓度340g/L左右，五糖混合液浓缩至质量浓度150g/L左右，分别上柱进行二次分离，分离条件与一次分离条件相同，各种糖组分分离的结果见图4。

图4 聚丙烯酰胺凝胶柱对三糖、四糖和五糖的二次分离Fig.4 The second column chromatography of polyacrylamide gel to tri-,tetra-and pentasaccharide

由图4（A）可以看出，首先洗脱出的是四糖，然后依次是三糖和乳糖。由于混合物中四糖和乳糖的含量较少，因而三者之间分离效果较好，大部分三糖都集中在51～57管共21mL的溶液中，收集这部分溶液，得到质量分数98.1%的低聚三糖组分，满足分析标准品的纯度要求，同时，三糖的收率也很高，达到95.5%。由图4（B）可以看出，四糖与五糖的分离效果较好，与三糖分离效果稍差，这是由于粗品混合物中的三糖含量相对偏高引起的。为了得到纯度较高的四糖标准品，收集48～51管中的溶液，得到质量分数98.3%的低聚四糖组分，达到了分析用标准品的纯度要求，四糖的收率为74.4%。由图4（C）可以看出，由于混合物中六糖和四糖的含量都很低，因而三种糖组分之间的分离效果都较好，收集43～46管中的溶液，得到五糖，其质量分数为98.7%，收率为96.7%。

3 结论

利用聚丙烯酰胺凝胶Bio-Gel P-2柱层析分离低聚半乳糖混合物，层析柱1.6cm×120cm分离的最佳操作条件是：蒸馏水为洗脱剂，操作温度50℃，洗脱流速15～20mL/h，进料量3mL。最佳分离条件下制备的三糖、四糖和五糖的纯度分别为84.5%、85.1%和87.9%，收率分别为85.9%、86.4%和88.7%。将收集的各种组分浓缩后二次分离，制备的三糖、四糖和五糖单一组分的纯度分别为98.1%、98.3%和98.7%，收率分别为95.5%、74.4%和96.7%，达到了分析用标准品的纯度要求。

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Study on preparation of high purity of galacto-oligosaccharides single components

HAN Xiao-li1，SU Fang-yun2，FENG Yong-mei1，CHANG Xiu-lian1，ZHANG Rui-lun1，LIU Geng-xin1
（1.College of Chemistry and Biology，Yantai University，Yantai 264005，China；2.Research Institute of Lanzhou Petrochemical Company，Lanzhou 730060，China）

Bio-Gel P-2 gel filtration chromatographic column was used for the purification of Galactooligosaccharides（GOS）mixture，by which the effect of column temperature，elution flow-rate and sample volume on the separation were studied.The results showed that the optimum separation could be obtained at 50℃，15～20mL/h and sample volume 3mL with the column of 1.6cm×120cm and elution solution of degassed distilled water.Products of tri-，tetra-and pentasaccahride with the purity of more than 85%were achieved under this condition.Followed the second column chromatography for the concentrate of above single products，more than 98%purity and the yield of 95.5%，74.4%and 96.7%of tri-，tetra-and pentasaccharide，respectively，were obtained，which could meet the requirements of the standardized sample.

polyacrylamide gel；Bio-Gel P-2；galacto-oligosaccharides；column chromatograph

TS201.2+3

B

1002-0306（2012）01-0238-03

2011－01－17

韩晓丽（1962-），女，大学本科，副教授，主要从事化工和生化分离方面的研究。

山东省科技攻关项目（2008GG10002043，2007GB01008）。