β-葡萄糖苷酶酶解刺嫩芽皂甙最佳工艺条件的研究

颜廷才，张 旋，孟宪军，张 琦

（沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110866）

β-葡萄糖苷酶酶解刺嫩芽皂甙最佳工艺条件的研究

颜廷才，张 旋*，孟宪军，张 琦

（沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110866）

以辽宁本溪产刺嫩芽提取的总皂甙为实验原料，探讨了β-葡萄糖苷酶水解刺嫩芽总皂甙的工艺条件与技术参数。采用苯酚-硫酸比色法测定葡萄糖含量，确定酶解效果。结果表明：葡萄糖浓度范围在0～0.1mg/mL内，其吸光值与葡萄糖浓度呈现良好的线性关系。单因素实验结果表明：考虑到β-葡萄糖苷酶水解成本与效率，50mg的刺嫩芽皂甙分别在β-葡萄糖苷酶用量为2.0mg，酶解温度为40℃，酶解处理时间为120min时的酶解效果最好。正交实验结果表明：对β-葡萄糖苷酶水解刺嫩芽皂甙的影响程度依次为酶解温度gt;酶用量gt;酶解时间，三因素的最佳水平组合为：在pH为6.5的缓冲液体系中，酶解温度为40℃，酶解时间为120min，用量为3.0mg。

刺嫩芽，β-葡萄糖苷酶，皂甙，刺嫩芽皂甙，酶解

刺嫩芽[Aralia elata（Miq）Seem]为五加科楤木属植物，又名龙牙楤木、刺老鸦、树头菜等。刺嫩芽营养丰富、口感佳，属山野菜中之珍品，素有“天下第一山珍”之美称[1]。刺嫩芽不仅是一种名贵山野菜，还含有丰富的皂甙类成分，具有较高的药用价值。刺嫩芽皂甙和人参皂甙相似，有消炎、利尿、强心、免疫和防癌等作用[2-4]，近年来皂甙成为有机化学、天然产物化学、生物医学的研究热点[5]。刺嫩芽皂甙含量虽然比人参高，但是毒性也比人参皂甙大，这限制了刺嫩芽皂甙的应用[6]。目前，对皂甙活性改造方面研究比较多的是人参皂甙，方法主要有酸催化水解法、乙酞解法、降解水解法、光解法、碱裂解法和酶水解法等[7-9]。酶水解法为一种选择性水解反应，达到定向水解的目的。高峰淀粉酶（Takacdiastase）、橙皮甙酶[10]、人体肠内细菌[11]、β-葡萄糖苷酶等水解人参皂甙得到高抗癌活性的皂甙单体[12]。由于原料和提取量的限制，对于刺嫩芽皂甙的活性研究局限于活性与结构之间的关系，Yoshikawa、Saito S等研究结果证明，以齐墩果酸或常春藤皂甙元为皂甙元的皂甙，在皂甙元的3位和28位上均有单糖链，活性较高[16]。但是，目前关于改进刺嫩芽皂甙结构来提高活性的方法研究方面，经过文献检索没有检索到相关的研究报道。本实验旨在通过研究β-葡萄糖苷酶水解处理刺嫩芽皂甙，降解掉部分糖基团，降低刺嫩芽皂甙毒性，提高其活性，扩大刺嫩芽皂甙的应用范围。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

刺嫩芽皂甙粗品 由本实验室自制；乙醇、氯仿、冰乙酸、苯酚、硫酸、正丁醇等试剂 均为分析纯，沈阳化学试剂厂；D（+）葡萄糖 上海化学医药公司；齐墩果酸标准品 中国药品生物制品检定所，批号：110709-200304，供含量测定用；β-葡萄糖苷酶 Sigma公司。

TDL-5000B型离心机 上海安亭仪器厂；微量进样器（25μL） 上海安亭微量进样器厂；UNICUV-4802H紫外可见分光光度计 上海分析仪器厂；HH-6型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；HZS-H水浴振荡器 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；RE-52型旋转蒸发仪 上海博通仪器厂；SH2-D（Ⅲ）循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂；PHS-25型酸度计 上海理达仪器厂；DEF真空干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；KQ-100DB型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；FA2004电子天平 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

表1 三因素三水平正交实验的因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.1 苯酚-硫酸法测定糖含量标准曲线的绘制 准确称取105℃烘干至恒重的标准葡萄糖25.0mg置于250mL容量瓶中，加水至刻度并摇匀，分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mL葡萄糖标准溶液，再加水补至1.0mL，然后加入5%苯酚1.6mL及浓硫酸7.0mL，充分摇匀，室温放置25min以后于490nm测定吸光度，以蒸馏水为空白按同样显色操作，以糖浓度（x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标，绘制标准曲线，计算出回归方程。

1.2.2 糖含量计算 称取50mg刺嫩芽皂甙，加入50mL pH为6.5的缓冲液和2mL 1mg/mL的β-葡萄糖苷酶，在40℃条件下水解90min，反应结束后，水解液用100mL正丁醇萃取，取下层水相，脱蛋白处理后测定体积，取1mL加入5%苯酚1.6mL及浓硫酸7.0mL，充分摇匀，室温放置25min后于490nm测吸光度，换算出糖的含量。

1.2.3 实验设计

1.2.3.1 单因素实验 β-葡萄糖苷酶用量对酶解效果的影响：称取50mg刺嫩芽皂甙，加入50mL pH为6.5的缓冲液和1、2、3、4、5mL 1mg/mL的β-葡萄糖苷酶，在40℃条件下水解90min，反应结束后，水解液用100mL正丁醇萃取，取下层水相，脱蛋白处理后测定体积，取1mL加入5%苯酚1.6mL及浓硫酸7.0mL，充分摇匀，室温放置25min后于490nm测定吸光度，换算出糖的含量。

酶解温度对酶解效果的影响：温度设置为20、30、40、50、60℃，水解90min，其他处理操作相同上。

酶解时间对酶解效果的影响：在40℃条件下，酶解时间为60、90、120、150、180min，其他处理操作同上。

1.2.3.2 正交实验 通过上述单因素实验确定三因素三水平正交实验的因素和水平，因素水平设计见表1，进一步确定主要影响β-葡萄糖苷酶酶解效果的因素和参数。

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖标准曲线

由图1可知，葡萄糖标准溶液吸光值曲线的方程为：Y=6.8557X，相关系数R2值达到0.9978。可见，葡萄糖浓度范围在0～0.1mg/mL内，其吸光值与葡萄糖浓度呈现良好的线性关系，可以采用苯酚-硫酸法测定葡萄糖含量，根据葡萄糖的吸光值换算出葡萄糖的浓度。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 The standard absorbency curve of glucose

2.2 酶用量对刺嫩芽皂甙酶解效果的影响

实验分别选择酶用量为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg，在水解温度为38℃，水解时间120min的条件下水解刺嫩芽皂甙，结果如图2所示。由图中变化趋势可以看出，随着β-葡萄糖苷酶使用量的增加，刺嫩芽皂甙的水解率逐渐升高，溶液中的单糖的浓度逐渐增加，但当加酶量超过2.0mg时，刺嫩芽皂甙的水解率增加幅度很小，这说明2.0mg β-葡萄糖苷酶经过2h的作用后，已经基本上把刺嫩芽皂甙里的葡萄糖全水解下来，因此，从成本方面考虑，本实验确定50mg的刺嫩芽皂甙酶用量为2.0mg。

图2 酶用量对刺嫩芽皂甙水解的影响Fig.2 Effect of β-glucosidase quantity on saponin hydrolyzation

2.3 酶解温度对刺嫩芽皂甙酶解效果的影响

分别选择酶解温度为20、30、40、50、60℃，水解时间120min，加酶量2.0mg的条件下用β-葡萄糖苷酶水解刺嫩芽皂甙，考察温度对水解的影响。由图3的结果可以看出，酶解温度对刺嫩芽皂甙糖苷键的水解程度影响很大，初期随着酶解温度的增加刺嫩芽皂甙溶液中的单糖含量逐渐升高，当酶解温度为40℃时，溶液中的单糖浓度趋近最大值0.059mg/mL，温度再升高，溶液中的单糖浓度反而迅速下降，这说明β-葡萄糖苷酶也属于不耐热的酶，超过其最佳作用温度以后，温度再升高会使酶部分失去活性，降低了水解能力，导致溶液中的单糖浓度降低。因此，β-葡萄糖苷酶最佳酶解温度为40℃。

图3 酶解温度对刺嫩芽皂甙水解的影响Fig.3 Effect of hydrolyzing temperature on saponins hydrolyzation

2.4 酶解时间对刺嫩芽皂甙酶解效果的影响

分别选择水解时间60、90、120、150、180min，在水解温度38℃，β-葡萄糖苷酶酶用量2.0mg的条件下对刺嫩芽皂甙进行水解，结果如图4所示。由图4中结果可以看出，随着酶解时间的延长，刺嫩芽皂甙的水解程度逐渐加强，单糖的含量也逐渐增加；但当酶解时间达到120min时，刺嫩芽皂甙的水解液中的单糖含量增加趋势变得极其微弱，这说明120min的时间β-葡萄糖苷酶作用基本完成，把大部分的β-葡萄糖苷键水解完成，时间再延长已经没有底物可以利用了，考虑到酶解的效率，因此酶解处理的最佳时间为120min。

图4 酶解时间对刺嫩芽皂甙水解程度的影响Fig.4 Effect of hydrolyzing time on saponins hydrolyzation

2.5 β-葡萄糖苷酶水解刺嫩芽皂甙的正交实验

表2 β-葡萄糖酶水解法正交实验结果分析表Table 2 The results of orthogonal test of β-glucosidase hydrolyzing saponins

在单因素实验的基础上，我们选择了酶用量为1.0、2.0、3.0mg，酶解温度35、40、45℃，酶处理时间100、120、140min，三个因素三水平对β-葡萄糖苷酶酶法水解条件进行正交实验，结果如表2所示。从表2中的极差分析结果可知，三因素对刺嫩芽皂甙水解的影响程度依次为酶解温度gt;酶用量gt;酶解时间，三因素的最佳水平组合为A2B2C3即在pH为6.5的缓冲液体系中，酶解温度为40℃，酶解时间为120min，β-葡萄糖苷酶用量为3.0mg，酶解后葡萄糖含量为0.070mg/mL。由表中的方差分析结果表明，β-葡萄糖苷酶酶解温度是影响水解程度的最重要的一个因素，酶解的温度不宜太高，温度高会导致β-葡萄糖苷酶失活或酶活力降低。由β-葡萄糖苷酶水解的工艺条件可以看出，此法的水解条件温和，具有水解率高，水解专一性好，水解程度可以控制等优点，适合于皂甙定向水解掉葡萄糖。β-葡萄糖苷酶酶解总皂甙后，高活性皂甙元以及总皂甙的活性是否提高还需要进一步实验确定。

3 结论

苯酚-硫酸法测定葡萄糖含量时，葡萄糖浓度范围在0.0～0.1mg/mL内，葡萄糖标准溶液吸光值曲线的方程为：Y=6.8557X，R2值达到0.9978，其吸光值与葡萄糖浓度呈现良好的线性关系。

单因素实验结果表明：考虑到β-葡萄糖苷酶水解的成本与效率，50mg的刺嫩芽皂甙分别在β-葡萄糖苷酶用量为2.0mg，酶解温度为40℃，酶解处理的时间为120min时，酶解效果最好。

正交实验结果表明：对β-葡萄糖苷酶水解刺嫩芽皂甙的影响程度依次为酶解温度gt;酶用量gt;酶解时间，三因素的最佳水平组合为A2B2C3，即在pH为6.5的缓冲液体系中，酶解温度为40℃，酶解时间为120min，用量为3.0mg，这些条件下酶解后的溶液中葡萄糖含量为0.070mg/mL。

[1]马志强.刺龙芽化学组成及生物活性的研究[D].沈阳：沈阳药科大学博士学位论文，2004.

[2]吴立东，赵凤珍.刺嫩芽资源的经营利用[J].林业勘查设计，2004，130（2）：53.

[3]石雪萍，姚惠源.植物皂甙测定方法的进展[J].理化检验：化学分册，2007（6）：86-89.

[4]颜廷才，刘静，孟宪军.HPLC法测定刺嫩芽皂甙中齐墩果酸的含量[J].食品研究与开发，2008（2）：114-116.

[5]方幼兰.玫瑰茄总皂甙的单体分离与结构分析[J].厦门大学学报：自然科学版，2004，43（5）：657.

[6]颜廷才，孟宪军，刘静.超声波提取刺嫩芽中齐墩果酸类皂甙的工艺研究[J].食品与发酵工业，2008（5）：170-173.

[7]Janaína Koelzer，Diana Ana Pereira，Juliana Bastos Dalmarco. Evaluation of the anti-inflammatory efficiency of Lotus corniculatus [J].Food Chemistry，2009，117：444-450.

[8]王文平.木瓜中齐墩果酸的分离提取及含量测定[J].食品科学，2004，25（9）：151-155.

[9]田燕.齐墩果酸微胶囊的制备与溶出度的测定[J].中国医院药学杂志，2007，27（1）：91-92.

[10]Cho Joonghyung，Lee Jiyun，Sim Sangsoo，et al.Inhibitory effects of diterpene acids from root of Aralia cordata on IgE-mediated asthma in guinea pigs[J].Pulmonary Pharmacologyamp; Therapeutics，2010（2）：1-10.

[11]奚树刚.龙芽葱木总皂苷对大鼠早期糖尿病心肌病及糖尿病肾病保护作用的实验研究[D].长春：吉林大学博士学位论文，2007.

[12]Min Songa.Determination of oleanolic acid in human plasma and study of its pharmacokinetics in Chinese healthy male volunteers by HPLC tandem mass spectrometry[J].Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2006（4）：190-196.

[13]Suh Seokjong，Jin Unho，Kim Kyungwoon，et al.Triterpenoid saponin，oleanolic acid 3-O-β-D-glucopyranosyl（1-3）-a-L-rhamnopyranosyl（1-2）-a-L-arabinopyranoside（OA）from Aralia elata inhibits LPS-induced nitric oxide production by downregulated NF-kB in raw 264.7 cells[J].Archives of Biochemistry and Biophysics，2007，46：227-233.

[14]Li Shigang，Wang Degui，Tian Wei.Characterization and antitumor activity of a polysaccharide from Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz[J].Carbonhydrate Polymers，2008，73：344-350.

[15]Nils Germonprez，Luc Vanpuyvelde，Louis Maes.New pentacyclic triterpene saponins with strong anti-leishmanial activity from the leaves of maesa balansae[J].Tetrahedron，2004，60：219-228.

[16]Lee Mihyun，Jeong Jaehun，Seo Jinwook.Enhanced Triterpene and Phytosterol Biosynthesis in Panax ginseng Overexpressing squalene synthase gene[J].Plantamp;Cell Physiology，2004（8）：976-984.

Optimizing the technologic conditions of aralosides hydrolyzed with β-glucosidase

YAN Ting-cai，ZHANG Xuan*，MENG Xian-jun，ZHANG Qi
（College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China）

The material was saponin extracted from Aralia elata（Miq）Seem saponins which planted in Benxi City Liaoning province.The technologic conditions and parameters of aralosides hydrolyzed by β-glucosidase were studied.Effects of hydrolyzation were testified by determining glucose’s concentration with colorimetry of phenol-sulfate acid.The results indicated：the absorbency presents good linearity with glucose’s concentration within 0.1mg/mL.The results of single factor test indicated：considering the cost and efficiency of glucosidase the effects of hydrolyzation were best at the condition of β-glucosidase dosage 2.0mg，hydrolyzing temperature 40℃ and hydrolyzing time 120min separately.The results of orthogonal test indicated：the order of the factors affecting notably hydrolyzation is hydrolyzing temperature，hydrolyzing time and β-glucosidase dosage.The best levels of the factors were hydrolyzing temperature 40℃，hydrolyzing time 120min and β-glucosidase dosage 3.0mg.

Aralia elata（Miq）Seem；β-glucosidase；saponin；elatoside；hydrolyzation

TS201.1

B

1002-0306（2012）01-0282-04

2010-09-13 *通讯联系人

颜廷才（1977-），男，博士，讲师，研究方向：果蔬深加工与活性物质提取。

沈阳农业大学青年基金项目（2005039）。