东北野生山榛子树皮、树叶、果皮中紫杉醇的超声辅助提取方法研究

陶冬冰，孟宪军，刘 彬

（沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110086）

东北野生山榛子树皮、树叶、果皮中紫杉醇的超声辅助提取方法研究

陶冬冰，孟宪军，刘 彬

（沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110086）

采用超声提取法对东北野生山榛子树的果皮、树皮、树叶进行了紫杉醇的提取，通过单因素实验和正交实验得出了最佳的超声辅助提取条件：乙醇浓度80%，超声频率300Hz，提取温度50℃，料液比1∶3，提取时间60min，三种样品（树皮、果皮、树叶）中紫杉醇的得率均为最大值。果皮中的提取率为0.0059%，树皮中的提取率为0.0048%，树叶中的提取率为0.0033%，最终确定果皮中紫杉醇的含量gt;树皮中紫杉醇的含量gt;树叶中的紫杉醇的含量。

榛子，紫杉醇，超声提取

榛子，属桦木科榛属植物，又称山板栗、尖栗、棰子等[1]。在世界范围内榛属有约20个品种，主要分布于亚洲、欧洲及北美洲；在中国境内共有8个种类及2个变种，分布于东北、华东、华北、西北及西南地区[2]。榛子里包含着抗癌化学成分紫杉酚[3]，可以治疗卵巢癌和乳腺癌以及其他一些癌症，可延长病人的生命期[4]。目前，紫杉醇的来源主要有：天然红豆杉植物提取、人工种植、化学半合成、化学全合成、生物合成、真菌发酵、植物组织细胞培养、基因工程[5]。迄今为止，紫杉醇的主要来源仍是从天然红豆杉属植物的茎皮中提取[6]。但是，由于红豆杉生长缓慢，又极少成林，资源十分有限，要获得1kg紫杉醇，需要104kg树皮，约4000棵红豆杉树[7]。本文采用东北野生山榛子的树皮及果皮进行紫杉醇的提取，可以大大缓解紫杉醇提取原料的资源短缺问题，并对东北野生山榛子的综合开发利用有一定的借鉴作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

野生山榛子树 均采自于铁岭地区，分别取树皮、树叶和果皮自然风干后粉碎，得到实验样品。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的预处理 取材为野生山榛子树，分别取树皮、树叶及果皮，自然风干后，通过粉碎机粉碎，然后过60目筛备用[8]。

1.2.2 超声提取方法 分别称取果皮、树皮、枝叶预处理样品100g，加80%乙醇的水溶液100mL[9]。选择超声的时间、超声波的频率、料液比、提取温度4个因素进行实验[10]，考察这四个因素对紫杉醇超声提取率的影响。将各因素取3水平，进行4因素3水平正交实验。超声提取结束后，过滤，滤液40℃时减压蒸去乙醇，得水溶液[11]。然后定容至100mL，准确吸取5mL处理后的提取液，测定其吸光度值[12]。考察超声波频率、提取温度、料液比、提取时间对提取结果的影响。

1.2.3 紫杉醇标准曲线的制备 显色剂选用茴香醛-硫酸-乙醇（1∶3∶50，V/V），精确称取紫杉醇标准品0.01g溶于50mL乙醇，使用可见-紫外分光光度计在190～300nm扫描以确定最大紫外吸收峰[13]。将上述溶液稀释为0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008mg/L，在233nm波长处测定吸光度值，以乙醇为对照，作标准曲线，紫外扫描图谱显示紫杉醇的最大吸收波长为233nm。得到回归方程：y=0.023x+0.067，R2=0.9977。

图1 紫杉醇测定标准曲线Fig.1 Standard curve of taxol detection

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

由于紫杉醇是一种复杂的二萜类化合物，难溶于水，不溶于石油醚，可溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷等有机溶剂，结合紫杉醇的溶解特性，本实验重点考察了三种试剂：甲醇、乙醇、丙酮，试剂浓度为80%，超声频率300Hz，超声时间60min，料液比1∶3，温度50℃进行提取实验。

表1 不同提取溶剂对紫杉醇提取率的影响Table 1 Extraction rate of taxol with different extracting solvent

根据实验结果显示：丙酮提取液＞乙醇、甲醇提取液提取率，但是从食品级考虑其他溶剂均具有毒性，故选择乙醇为提取溶剂。

2.2 超声提取过程中不同因素对提取率的影响

图2 超声频率对提取率的影响Fig.2 Ultrasonic frequency on extraction rate

2.2.1 超声频率对提取率的影响 在乙醇浓度为80%，温度为50℃，提取时间60min，料液比l∶3的条件下，考察超声波频率对提取率的影响。由图2可见，随着超声波功率的增加，三种样品（果皮、树皮、树叶）吸光度逐渐增大，提取率逐渐增大，但是超声波频率大于250Hz后，吸光度值增加很少，提取率增量也随之减小，同时考虑到经济性和超声波频率过高可能使原材料降低活性，所以选择超声波频率范围为200、250、300Hz。

2.2.2 温度对提取率的影响 在超声波频率为300Hz，乙醇浓度80%，提取时间60min，料液比1∶3的条件下，考察提取温度对紫杉醇提取的影响，结果表明（图3），随着温度升高，三种样品（果皮、树皮、树叶）吸光度值逐渐增加。但温度过高（gt;40℃），吸光度值逐渐下降，提取率也缓慢下降，并在逐渐升温后持续下降，所以选择温度范围为30、40、50℃。

图3 温度对提取率的影响Fig.3 Temperature on extraction rate

2.2.3 料液比对提取率的影响 在超声波频率为300Hz，乙醇浓度为80%，提取温度50℃，提取时间60min的条件下，考察料液比对紫杉醇提取率的影响。

图4 料液比对提取率的影响Fig.4 Ratio of material to liquid on extraction rate

图4的实验结果表明，当料液比≤1∶3时，三种样品（果皮、树皮、树叶）吸光度值反而下降，这有可能是因为溶剂体积的增多使除紫杉醇以外的其他杂质溶出，从而抑制紫杉醇的溶出。所以选择料液比范围为1∶2、1∶3、1∶4。

2.2.4 提取时间对提取率的影响 在料液比（g/mL）为1∶3，乙醇浓度80%，超声波频率为300Hz，温度为50℃的条件下，考察提取时间对紫杉醇提取的影响。

实验结果（图5）表明，超声波提取时间为60min时，提取效果最好。当时间延长时，三种样品（果皮、树皮、树叶）吸光度反而下降，这可能是由于超声波的机械剪切作用，长时间加热使大分子断裂，在后处理中损失。从而使吸光度值降低，最后导致提取率的降低，所以选择提取时间范围为50、60、70min。

图5 提取时间对提取率的影响Fig.5 Extracting time on extraction rate

2.3 正交实验

根据以上单因素实验结果，确定因素水平范围如下：超声频率（A）分别为200、250、300Hz；料液比（B）分别为：1∶2、1∶3、1∶4；温度（C）分别为：30、40、50℃；提取时间（D）分别为50、60、70min。

表2 正交实验因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments

因三种原料得率具有一定规律，故只选取得率较高的果皮进行四因素三水平正交实验，正交实验的结果如表3。

表3 正交实验方案及结果分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments

从正交实验可以看出：超声频率（A）对得率的影响最大，其次是料液比（B），之后是提取时间（D），最后是提取的温度（C）。根据正交实验得到的最佳工艺条件为：即频率300Hz，料液比1∶3，超声提取温度为50℃，超声提取时间为60min。

2.4 验证实验

根据正交实验结果分别对果皮、树皮、树叶三种原料进行验证实验，采用优化后的条件：即乙醇浓度80%，频率300Hz，料液比1∶3，超声提取温度为50℃，超声提取时间为60min。进行三次重复实验，取平均数得到果皮中的紫杉醇提取率为0.0059%，树皮中的提取率为0.0048%，树叶中的提取率为0.0033%。

3 结论

本文通过超声提取法提取了东北地区野生山榛子果皮、树皮、树枝中的紫杉醇含量，通过实验选择最佳条件为：乙醇浓度为80%，超声频率300Hz，料液比为1∶3，温度为50℃，提取时间为60min。其中超声频率对于实验结果影响最为显著，提取的温度相对影响比较小。

最后通过实验结果综合分析得出，果皮中紫杉醇的含量（0.0059%）高于树皮中紫杉醇的含量（0.0048%）高于树叶中紫杉醇的含量（0.0033%）。

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Study on ultrasonic extraction technology of taxol from leaves，bark，fruit peels of northeast wild hazel

TAO Dong-bing，MENG Xian-jun，LIU Bin
（Shenyang Agriculture University，Shenyang 110086，China）

This thesis adopts ultrasonic extraction method to extract the taxol from fruit peels，tree bark and tree leaves of the northeast wild hazel trees.According to single factor experiment and orthogonal experiment，the optimum ultrasound-associated extraction conditions were showed as follows：concentration of ethanol was 80%，ultrasonic frequency was 300Hz，extraction temperature was 50℃，RMV（ratio of material to liquid）was 1∶3 and extracting time was 1h.The taxol’s yield rates of three kinds of samples（tree bark，fruit peel，tree leaves）were all the maxima.The extraction rate of fruit peel was 0.0059%，the extraction rate of tree bark was 0.0048% and the extraction rate of tree leaves was 0.0033%.At last，it comes to the conclusion that the taxol content of fruit feel＞the taxol content of tree bark＞the taxol content of tree leaves.

hazelnut；taxol；ultrasonic extraction

TS255.1

B

1002-0306（2012）01-0299-03

2010－12－06

陶冬冰（1983-），男，硕士，实验师，主要从事植物中生理活性物质提取及功能性研究。