响应面分析法优化菊芋渣中蛋白的提取工艺

张 维，李雪雁，张秀兰，胡志明，李 冰

（兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730050）

响应面分析法优化菊芋渣中蛋白的提取工艺

张 维，李雪雁*，张秀兰，胡志明，李 冰

（兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730050）

以菊芋渣为研究对象，用蛋白质提取率作为衡量提取工艺的指标。在单因素实验基础上，选取pH、提取温度、提取时间为自变量，蛋白提取率为响应值，利用Box-Benhnken中心组合设计原理和响应面分析法，研究各自变量及其交互作用对提取率的影响，模拟得到二次多项式回归方程的预测模型，在固液比为1∶30（g/mL）的条件下，确定最佳提取条件为pH14.0、提取温度82℃、提取时间2h。在此条件下，平均蛋白提取率为22.7747mg/g。与理论预测值23.3187mg/g相比，其相对误差约为2.33%。说明通过响应面优化后得出的回归方程具有一定的实践指导意义。

菊芋渣，蛋白，提取，响应面分析法

菊芋（俗称洋姜）是多年生菊科植物，我国南北各地均有种植。它除了含菊糖外，还含有一定数量的蛋白质、果胶、纤维素及其他成分。目前对菊芋的研究主要集中在以下几个方面：菊芋中菊粉的提取，纯化和功能；菊芋叶中活性成分的研究；菊芋治理沙漠的研究；微生物产菊粉酶的研究等。而菊芋加工后的副产品菊芋渣中粗蛋白含量达9.6%[1]（相对干基），粗脂肪含量1.6%，是各种畜禽的良好饲料。1t菊芋块茎加工后可得菊芋渣650kg[1]（水分含量约为83%），如若长期堆弃，不仅污染环境，而且会造成资源的浪费。本实验着重对菊芋渣蛋白质的提取工艺进行了研究，得到了菊芋渣蛋白质的最佳提取条件，为今后菊芋蛋白质的大规模生产和其产品的深加工提供了可行性依据，对菊芋的综合利用及新产品的开发提供基础研究资料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菊芋渣 白银熙瑞生物工程有限公司提供；盐酸、氢氧化钠、无水乙醇、磷酸 均为分析纯；考马斯亮蓝G-250 上海绿鸟科技发展公司；所用其他试剂均为分析纯。

TGL-16C高速台式离心机 上海安亨科学仪器厂；722s可见光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；HHS电热恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；ALC-110.4电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；85-2磁力搅拌器 上海浦东物理光学仪器厂；PHS-3C pH计 上海伟业仪器厂；FD-1型冷冻干燥机 北京博医康实验仪器。

1.2 实验方法

1.2.1 分离蛋白的提取工艺流程 菊芋渣→干燥（自然风干）→粉碎（60目）→搅拌浸提→离心（3000r/min）→取上清液→调pH至等电点→离心 （4000r/min）→取沉淀→调pH至7.0→透析脱盐→真空冻干→粗蛋白粉

1.2.2 提取工艺最优参数的确定 在单因素实验时，用菊芋渣与菊芋干粉的蛋白提取率作对照，依次改变菊芋渣碱提液的pH、温度和碱提时间，以菊芋渣蛋白得率作为评价指标进行研究和分析，并确定三因素三水平的最佳参数进行响应面分析[2-4]。实验设计中的水平及编码表见表1。

表1 响应面实验因素水平编码表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.3 蛋白提取率的测定 蛋白提取率（mg/g）=提取液中蛋白质总蛋白质量（mg）/原料的总质量（g）

提取液中蛋白质含量测定：采用考马斯亮蓝法[5]。取0.1mL提取液，加入考马斯亮蓝染液5mL，混匀，静置3min，在波长595nm处测吸光度；依蛋白标准曲线的回归方程y=0.3761x-0.0085（R2=0.9961）计算可溶性蛋白的含量。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 碱液pH对菊芋蛋白提取率的影响 碱液浸提菊芋渣过程中控制体系的温度80℃、料液比1∶30（g/mL）、浸提时间60min，设置不同pH的碱液。碱液pH对菊芋渣蛋白提取的影响结果见图1。蛋白质溶解度随pH升高而增大，蛋白质溶出增多。从图1可知，随着碱液pH增加，蛋白提取率呈增加的趋势，其中pH为13.5时蛋白提取率最高，而后蛋白含量趋于稳定。而菊芋干粉在pH为13时，蛋白提取率达到最高，可见菊芋的加工过程使其中蛋白的碱耐受性增加。综合考虑两评价指标的最佳pH，选取pH13、13.5、14继续对菊芋渣蛋白的提取做响应面分析以确定最佳的碱液pH。

图1 pH对菊芋蛋白提取率的影响Fig.1 Influence of pH value on Jerusalem artichoke protein extraction rate

2.1.2 浸提温度对菊芋蛋白提取率的影响 用碱液浸提菊芋蛋白过程中控制体系pH13.5、浸提时间60min、料液比1∶30（g/mL），设置不同的温度，研究浸提温度对菊芋渣蛋白提取率的影响见图2。从图2可知，随着温度的升高，蛋白提取率逐渐提高，80℃以上蛋白提取率趋于不变；蛋白提取率随温度升高，先升高再趋于稳定，80℃时蛋白提取率最高。而且菊芋干粉的蛋白提取率也在80℃时趋于稳定。综合考虑两评价指标确定温度为70、80、90℃继续对菊芋渣蛋白的提取做响应面分析以确定最佳的浸提温度。

图2 提取温度对菊芋蛋白提取率的影响Fig.2 Influence of extracting temperature on Jerusalem artichoke protein extraction rate

2.1.3 浸提时间对菊芋蛋白提取率的影响 碱液浸提菊芋蛋白过程中控制体系的温度80℃、料液比1∶30（g/mL）、碱液pH13.5，设置不同的浸提时间，研究浸提时间对菊芋渣蛋白制备的影响，结果见图3。如图3所示，蛋白提取率随着时间的增加而增加，2h以后提取率开始下降，而蛋白提取率随时间增加先提高再下降。这个过程可能是浸提时间延长，蛋白的溶出增加，一定时间后，蛋白的溶出达到饱和，则溶出率趋于平衡，若再进一步延长浸提时间，可能因为微生物生长等因素使蛋白质变性从而使提取率降低。而菊芋干粉中蛋白的溶出则在1h时达到饱和。综合评价两指标的最佳浸提时间段，选取1、2、3h继续做响应面分析以确定最佳的浸提时间。

图3 提取时间对菊芋蛋白提取率的影响Fig.3 Influence of extracting time on Jerusalem artichoke protein extraction rate

2.1.4 料液比对菊芋蛋白提取率的影响 碱液浸提菊芋渣蛋白过程中控制体系的温度80℃、浸提时间2h、碱液pH13.5，设置不同的料液比，研究料液比对菊芋渣蛋白制备的影响，结果见图4。如图4所示，菊芋干粉蛋白提取率随碱液量的增加变化不大，而菊芋渣蛋白提取率则随碱液量增加而提高。从图4可以看出，在料液比1∶30（g/mL）左右，蛋白溶解较为充分。

图4 固液比对菊芋蛋白提取率的影响Fig.4 Influence of solid-liquid ratio on Jerusalem artichoke protein extraction rate

2.2 响应面法提取条件的优化

2.2.1 响应面实验设计及结果 根据Box-Behnken[6]中心组合实验设计原理，综合分析单因素实验，确定提取料液比为1∶30，选取对菊芋渣蛋白提取影响显著的3个因素（pH、提取温度、提取时间），设计了3因素3水平的响应面分析实验。

表2 Box-Behnken实验设计及结果Table 2 Results of response surface experiments

使用Design Expert7.0软件，以pH、提取温度、提取时间为响应变量，以菊芋渣蛋白提取率为响应值（指标值）对表3的数据进行处理，得到表3回归方程方差分析表，利用软件进行非线性回归的二次多项式拟合，得到预测模型如下：Y=18.63+5.38A+0.80B+ 0.44C+0.68AB+0.55AC-0.26BC-0.88A2-0.44B2-4.25C2

表3为回归分析结果，回归方差分析显著性检验表明，该模型回归显著（p＜0.0001），失拟项不显著，并且该模型R2=0.9953，R2Adj=0.9893，说明该模型与实际实验拟合较好，自变量与响应值之间线性关系显著，可以用于菊芋渣蛋白提取工艺实验的预测。

方差分析结果还表明，方程的一次项中A、B对响应值的影响显著，二次项A（pH）、B（提取温度）、C（浸提时间）对响应值的影响显著。由此可见，各具体实验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。

各因素的影响程度分析，各因素的F值可以反映出各因素对实验指标的重要性，F值越大，表明对实验指标的影响越大，即重要性越大。从方差分析表可知：FA=615.09，FB=13.50，FC=4.19，即各因素对碱溶性蛋白提取率的影响程度大小顺序为：pH＞提取温度＞提取时间。

根据回归方程，做出响应面分析图（图5～图7），考察所拟合的响应曲面的形状，分析pH、提取温度、提取时间对菊芋渣蛋白提取率的影响。

2.2.2 各因素之间的交互作用 见图5～图7。

表3 回归方程方差分析表Table 3 Analysis results of regression and variance

图5 pH和提取温度对蛋白提取率影响的响应面图Fig.5 Response surface of pH and extraction temperature on the extraction rate of protein

图6 提取时间和pH对蛋白提取率影响的响应面图Fig.6 Response surface of pH and extraction time on the extraction rate of protein

2.2.3 提取工艺条件的验证 为进一步确定最佳点，在模型浓度范围内选择出发点，使用快速上升法进行优化得到的菊芋蛋白提取的最佳方案为：pH14.00，提取温度81.79℃，提取时间：2.11h，菊芋渣蛋白得率23.3187mg/g。为检验响应曲面法所得结果的可靠性采用上述优化提取条件提取南瓜多糖，考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为pH14.0，提取温度82℃，提取时间2h。以上述条件进行实验结果的验证，重复3次实际测得的蛋白得率分别为22.6252、23.1173、22.5890mg/g，平均蛋白得率为22.7747mg/g。与理论预测值相比，其相对误差约为2.33%。说明通过响应面优化后得出的回归方程具有一定的实践指导意义。

图7 提取时间和提取温度对蛋白提取率影响的响应面图Fig.7 Response surface of extraction time and extraction temperature on the extraction rate of protein

3 结论

采用碱提的方法对菊芋渣中蛋白质进行提取，通过单因素实验和Box-Behnken中心组合设计原理以及响应面分析法对提取工艺进行优化，拟合了pH、提取温度、提取时间这3个因素对蛋白的原料提取率的回归模型，经检验证明该模型合理可靠，能较好地预测菊芋渣中碱溶性蛋白的原料提取率。由该模型确定的最优工艺条件为pH14.0，提取温度82℃，提取时间2h。在此条件下，得到菊芋渣平均蛋白得率为22.7747mg/g。通过模型系数显著性检验，得到因素的主效应关系为：pH＞提取温度＞提取时间。

同时，在单因素实验时与菊芋干粉做了对照实验。结果表明虽然菊芋干粉中碱溶性蛋白的提取率比菊芋渣的高，但从资源充分利用的角度来看，菊芋渣还是具有很大的开发潜力。目前，国内外对菊芋渣的研究未见报道，因此，为了充分开发利用菊芋渣蛋白这一植物蛋白资源，仍需加大科研力度，完善菊芋蛋白提取分离基本理论和方法，满足工业产业化生产的要求。

[1]秦亚兵，徐长警，王华，等.宁夏兴建菊芋系列产品加工业的构想与建议[J].宁夏农林科技，2004（1）：31-35.

[2]矫丽媛，吕敬军，陆丰升，等.花生分离蛋白提取工艺优化研究[J].食品科学，2010，20（31）：196-201.

[3]李明妹，姚开，贾冬英.碱提酸沉法制备花生分离蛋白的优化条件[J].中国油脂，2004，29（11）：21-23.

[4]陈学玲，罗金国，何建军，等.大豆11S球蛋白提取分离方法研究[J].中国粮油学报，2007，22（1）：160-163.

[5]赵英永，戴云，崔秀明，等.考马斯亮蓝G-250染色法测定草乌中可溶性蛋白质含量[J].云南民族大学学报：自然科学版，2006，15（3）：235-237.

[6]BOXG E P，BEHNKEN D W.Some new three level designs for the study of quantitative variables[J].Technometrics，1960（2）：455-475.

Optimization of extraction conditions of protein from Jerusalem artichoke residue by response surface methodology

ZHANG Wei，LI Xue-yan*，ZHANG Xiu-lan，HU Zhi-ming，LI Bing
（School of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Science and Technology，Lanzhou 730050，China）

Jerusalem artichoke residue as the research object，with the protein extraction rate as a measure indicator.Three extraction parameters including pH，extraction temperature and extraction time were optimized using central composite design and response surface methodology based on single factor investigations for achieving maximum the protein extraction rate.The interaction of the respective variables and their influence on the extraction rate were studied by using Box-Benhnken central composite design and response surface analysis theory，the simulated quadratic polynomial regression equation of prediction model was set up.Under the condition of solid-liquid ratio1∶30（g/mL），the optimum extraction condition for pH14，extraction temperature 82℃，extraction time of 2h.Under these conditions，the average protein yield ratio was 22.7747mg/g，compared to the theoretical value，the relative error of 2.33%.Optimized by response surface regression equation derived some practical significance.

Jerusalem artichoke residue；protein；extraction；response surface analysis

TS255.1

B

1002-0306（2012）01-0305-04

2011－01－17 *通讯联系人

张维（1986-），男，硕士，研究方向：应用分子酶学。

甘肃省教育厅研究生导师基金项目（0908ZTB011）。