Hansenula anomala转化葡萄糖生产阿拉伯糖醇的研究

唐晓芳，张国栋，*，王 刚

（1.西华大学生物工程学院，四川成都610039；2.四川省食品发酵工业研究设计院，四川成都611130）

Hansenula anomala转化葡萄糖生产阿拉伯糖醇的研究

唐晓芳1，张国栋1，*，王 刚2

（1.西华大学生物工程学院，四川成都610039；2.四川省食品发酵工业研究设计院，四川成都611130）

对Hansenula anomala转化葡萄糖生产D-阿拉伯糖醇的反应条件进行了研究。高供氧量有利于阿拉伯糖醇的生成。在一定范围内，葡萄糖初始浓度越高，阿拉伯糖醇的产量也随之明显提高。并通过正交实验，确定了最佳发酵条件为（g/L）：葡萄糖500，酵母膏2，蛋白胨2，CaCl20.5，（NH4）2SO45，MgSO41，KH2PO43，pH5.0；发酵温度30℃，装液量15～20mL/500mL三角瓶，发酵时间263h。阿拉伯糖醇浓度为245.97g/L，转化率为0.49g阿拉伯糖醇/g葡萄糖，平均反应强度0.935g/Lh。

异常汉逊氏酵母（Hansenula anomala），D-阿拉伯糖醇，发酵

D-阿拉伯糖醇（D-Arabitol），是一种功能性食品添加剂，由于其可作为低热量、非龋齿甜味剂而备受关注，此外，它也是许多有应用价值的药物中间体[1]，具有很大的研究和应用价值。由于这种五碳多元醇有多种同分异构体存在，导致化学方法合成十分困难。在高渗透压环境中（高盐或高糖含量），耐高渗透压酵母菌会在细胞内累积产生多元醇。这些多元醇，特别是甘油和阿拉伯糖醇，能对细胞起到协调细胞功能和渗透调节作用，所以叫做稳定溶质（compatible solute）[2-5]。转化葡萄糖形成阿拉伯糖醇，是由于酵母细胞在高的葡萄糖浓度下，会增强磷酸戊糖途径，产生充足的有利于细胞生长和合成的NADPH。通过NADP+再生，从而形成阿拉伯糖醇。也就是说，阿拉伯糖醇经由D-ribulose-5-phosphate脱磷酸，然后在D-阿拉伯糖醇脱氢酶催化下形成。反应需要NADPH参与完成。能够转化葡萄糖形成阿拉伯糖醇的酵母菌有Saccharomyces、Debaryomyces、Hansenula、Pichia和Candida[3，6]。目前对阿拉伯糖醇的研究报道还很少。蔡莉等从含糖量高的自然界样品中分离产阿拉伯糖醇的菌株，获得1株产量较高的耐高渗酵母[7]。张丽丽等利用汉逊德巴利酵母发酵葡萄糖生产D-阿拉伯糖醇，研究了影响其发酵的因素和最佳发酵条件[8]。本实验研究了Hansenula anomala转化葡萄糖生产D-阿拉伯糖醇的影响因素，并摸索有利于阿拉伯糖醇形成的条件，为大规模生产D-阿拉伯糖醇提供有益的指导和帮助。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株Hansenula anomala strain GA24 中国科学院微生物所保存；斜面与平板培养基 麦芽汁琼脂培养基；种子培养基（g/L） 葡萄糖300g，酵母膏5g，蛋白胨5g，pH 5.0；发酵培养基 除了实验中另行说明外，均与种子培养基相同，上述培养基均采用112.6℃灭菌30min。

1.2 实验方法

1.2.1 培养与发酵条件 种子培养：500mL三角瓶装入50mL培养液，接入试管斜面菌体1环，30℃、220r/min摇床培养48h。发酵培养：500mL三角瓶，装液量根据实验而定。接入种子液，接种量5%。30℃、220r/min摇床培养，隔时取样分析。

1.2.2 检测方法

1.2.2.1 细胞量测定 分光光度计测量OD650来表示细胞浓度。

1.2.2.2 葡萄糖含量测定 采用SBA-40型谷氨酸（乳酸）-葡萄糖双功能分析仪。

1.2.2.3 阿拉伯糖醇和甘油浓度采用HPLC测定 样品经过12000r/min离心5min，除去菌体和杂质。HPLC检测条件为：色谱柱HPX-87H，柱温45℃，流动相8mmol/L H2SO4，流速0.5mL/min，检测器RI@8x，进样量10μL。

2 结果与分析

2.1 阿拉伯糖醇发酵时间曲线和规律

图1为阿拉伯糖醇发酵随时间变化曲线。从图中可看出，随着时间的进行，葡萄糖浓度逐步降低，而阿拉伯糖醇、甘油的含量以及细胞量则逐步升高，在葡萄糖消耗完毕时，阿拉伯糖醇、甘油的含量以及细胞量都达到最大。

图1 阿拉伯糖醇浓度随发酵时间关系曲线Fig.1 Relationship of D-Arabitol concentration and fermentation time

为了进一步探明阿拉伯糖醇生成的规律，特别是发酵后期，葡萄糖消耗完毕后阿拉伯糖醇的浓度变化，采用如下发酵条件进行了实验（g/L）：葡萄糖500，酵母膏2，蛋白胨2，CaCl20.5，（NH4）2SO45，MgSO41，KH2PO43，pH5.0，装液量20mL/500mL三角瓶。实验结果见图2、图3。

在图2中可看到，从发酵时间达到119h开始，此时葡萄糖已经消耗完毕，而阿拉伯糖醇的浓度却开始迅速增大，直到263h达到最大值245.97g/L，转化率为0.49g阿拉伯糖醇/g葡萄糖，平均反应强度0.935g/L·h。

由于葡萄糖已经消耗为零，而其他营养物质如酵母膏、蛋白胨以及无机盐，经过长时间的发酵，也几乎没有残留。所以，在发酵后期这种阿拉伯糖醇迅速增加的现象，不可能是酵母细胞利用营养成分转化的结果。唯一可行的解释是，Hansenula anomala在高渗透压环境中（高的葡萄糖含量），积累形成的大量胞内物质/阿拉伯糖醇和甘油，能对细胞起到稳定和调节作用。而一旦外界环境中高渗物质葡萄糖消耗殆尽，阿拉伯糖醇和甘油作为稳定溶质就失去在细胞中存在的基础和意义，并从细胞内向细胞外转移渗透，从而出现发酵后期这些物质在培养液中浓度继续增加的现象。

所以，在培养液中葡萄糖耗尽后，继续对细胞发酵培养是必要的，这有利于细胞内阿拉伯糖醇的渗出，提高阿拉伯糖醇的产量和得率。

图2 葡萄糖消耗完毕后阿拉伯糖醇浓度随发酵时间变化曲线Fig.2 Relationship of D-Arabitol concentration and fermentation time after the glucose consumed

图3 葡萄糖消耗完毕后阿拉伯糖醇转化率和平均反应强度随发酵时间变化规律Fig.3 Relationship of D-Arabitol production and fermentation time after the glucose consumed

2.2 装液量对阿拉伯糖醇发酵的影响

氧的供应对阿拉伯糖醇的产生非常重要。资料报道认为，高的氧供应可以增强磷酸戊糖途径，累积NADPH[6，9]。通过NADP+再生，形成阿拉伯糖醇。实验采用改变装液量来摸索氧对阿拉伯糖醇产生的影响。

图4 装液量对阿拉伯糖醇、甘油产量以及细胞量的影响Fig.4 Effect of aeration rate upon D-Arabitol,glycerol and biomass yield

实验可得出，装液量越少越有利于阿拉伯糖醇的转化。同时，装液量越少，细胞量也越大。在装液量为15、20mL时，没有产生甘油。在所有实验中，我们发现甘油作为副产物，含量较少，但是遗憾的是，在实验条件下，它似乎没有表现出产生的规律。

高的氧供应有利于阿拉伯糖醇的形成，是由于增强了磷酸戊糖途径的结果。此外，我们发现，所有的实验都显示了这样一个规律：细胞量大，阿拉伯糖醇的产量就高。而良好的供氧，正好有利于细胞的生长。所以，在另一方面，高的氧供应可以促进阿拉伯糖醇的产生，也正是因为其可以促进细胞生长的结果。

2.3 初始葡萄糖浓度对阿拉伯糖醇发酵的影响

图5 葡萄糖初始浓度对阿拉伯糖醇发酵的影响Fig.5 Effect of initial glucose concentration on D-Arabitol yield

图6 葡萄糖初始浓度对阿拉伯糖醇转化率和平均反应强度的影响Fig.6 Effect of initial glucose concentration on D-Arabitol production

图5的实验结果可知，葡萄糖初始浓度越高，阿拉伯糖醇的产量也随之明显提高。细胞量在初始浓度为400g/L时达到最大，葡萄糖浓度升高到500g/L，则略有下降，说明葡萄糖初始浓度过高会对细胞生长有所抑制。在图6中，随着葡萄糖浓度的提高，平均反应强度也逐步增大。当葡萄糖浓度为400g/L时，转化率最高。最终确定500g/L的葡萄糖初始浓度作为最佳发酵条件，虽然其转化率不是最大，但是它的阿拉伯糖醇产量和平均反应强度均是最好。

2.4 氮源和无机盐对阿拉伯糖醇发酵的影响

为进一步研究氮源和无机盐对阿拉伯糖醇发酵的影响，获得最佳发酵培养基配方，正交实验L8（27）被设计进行。转化率（g阿拉伯糖醇/100g葡萄糖）作为实验结果进行正交数据分析，同样，把阿拉伯糖醇产量或者平均反应强度作为数据分析将得到完全相同的结果。

表1 阿拉伯糖醇发酵条件正交实验因素与水平表Table 1 Factors and levels of L8（27）orthogonal test on DArabitol fermentation

从正交实验结果分析来看，各因素的极差，与空白项相比，都较小，说明各单一因素对阿拉伯糖醇发酵的影响不显著。最佳因素水平为A2B1C1D1E1F1。但是，从表3则发现，酵母膏在水平1时结果更好，而且此时酵母膏用量低，节约成本。所以，确定最佳发酵条件为A1B1C1D1E1F1，即（g/L）：葡萄糖500，酵母膏2，蛋白胨2，CaCl20.5，（NH4）2SO45，MgSO41，KH2PO43，pH5.0；发酵温度30℃，装液量15～20mL/500mL三角瓶，发酵时间263h，阿拉伯糖醇浓度245.97g/L，转化率为0.49g阿拉伯糖醇/g葡萄糖，平均反应强度0.935g/L·h。

3 结论

表2 L8（27）正交实验结果数据处理Table 2 Result of L8（27）orthogonal test

表3 酵母膏与其他各因素的交互作用Table 3 Interaction of yeast extract and other factors

阿拉伯糖醇作为多元糖醇的一种，在机体内的代谢与胰岛素无关，同时又不是口腔微生物的适宜作用底物，所以食用不致牙齿龋变，而且大部分多元醇能量较低，因此是一类重要的功能性食品添加剂和基料。D-阿拉伯糖醇的应用较广泛。在食品领域，除用作新型高档食品甜味剂外，还可改善酒精饮料的品质、并可用做调制糖浆的基质等。在医药领域，是合成一些神经药物的中间体。

本文应用耐高渗酵母Hansenula anomala，转化葡萄糖生产D-阿拉伯糖醇，研究了发酵的主要影响因素和发酵条件。结果表明，培养基中葡萄糖含量以及发酵过程中的溶氧对其发酵影响较大。提高发酵中的供氧，有利于阿拉伯糖醇的生成；同时，葡萄糖初始浓度越高，阿拉伯糖醇的产量也明显提高。我们也对D-阿拉伯糖醇发酵的培养基配方进行了研究，确定了最优的发酵条件：在最佳培养基条件下，装液量15～20mL/500mL三角瓶，30℃发酵时间263h，得到产物阿拉伯糖醇浓度为245.97g/L，转化率为0.49g阿拉伯糖醇/g葡萄糖，平均反应强度0.935g/Lh。

[1]Hajny GJ.D-Arabitol production by Endomycopsis chodati [J].Appl Microbiol，1964，12：87-92.

[2]Da Costa MS，Niederpruem DJ.Arabitol Accumulation in Geotrichum candidium[J].Arch Microbiol，1982，131：283-286.

[3]Moran JW，Witter LD.Effect of Sugars on D-Arabitol Production and Glucose Metabolism in Saccharomyces rouxii[J]. J Bacteriol，1979，138：823-831.

[4]Nobre MF，Da Costa MS.Factors Favouring the Accumulation of Arabitol in the Yeast Debaryomyces hansenii[J].Can J Microbiol，1985，31：467-471.

[5]Da Costa MS，Niederpruem DJ.Temporal Accumulation of Mannitol and Arabitol in Geotrichum candidium[J].Arch Microbiol，1980，126：57-64.

[6]Ingram JM，Wood WA.Enzymatic Basis for D-Arabitol Production by Saccharomyces rouxii[J].J Bacteriol，1965，89：1186-1194.

[7]蔡莉，张扬，朱宏阳，等.1株产D-阿拉伯糖醇的菌株的分离筛选及鉴定[J].食品与发酵工业，2009，35：23-26.

[8]张丽丽，廖德芳，丁重阳，等.汉逊德巴利酵母发酵葡萄糖生产D-阿拉伯糖醇[J].工业微生物，2010，40（4）：47-52.

[9]Escalante J，Caminal G，Figueredo M，et al.Production of Arabitol from Glucose by Hansenula polymorpha[J].J Ferment. Bioeng，1990，70：228-231.

[10]贺鹏.细菌血红蛋白基因vgb在产D-阿拉伯糖醇酵母菌中的克隆与表达[D].北京：中国科学院微生物研究所，2000.

Study on production of arabitol from glucose by Hansenula anomala

TANG Xiao-fang1，ZHANG Guo-dong1，*，WANG Gang2
（1.Department of Bioengineering，Xihua University，Chengdu 610039，China；2.Sichuan Provincial Food Fermentation Industry Research and Design Institute，Chengdu 611130，China）

Production of D-arabitol from glucose by Hansenula anomala strain GA24 was studied.Some of the influencing factors were determined：aeration，osmotic pressure and medium.The best fermentation conditions were （g/L）：glucose 500，yeast extract 2，peptone 2，CaCl20.5，（NH4）2SO45，MgSO41，KH2PO43，pH5.0；the temperature at 30℃，15～20mL medium contained in 500mL Erlenmeyer flask，and 263h of cultivation.

Hansenula anomala；D-Arabitol；fermentation

TS201.2

A

1002-0306（2012）01-0314-04

2010－12－22 *通讯联系人

唐晓芳（1986-），女，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。