全硫代反义hTR对人子宫内膜癌细胞生长的抑制作用

夏丽娟 李洪秀 李德华

在多数人类原发恶性肿瘤中，85%以上发现有端粒酶活性，但在人正常细胞(除生殖细胞、淋巴细胞和造血干细胞外)则为阴性［1］。设计互补于hTR模板区的反义寡核苷酸封闭该模板区，就可抑制端粒酶合成端粒，从而使细胞退出增殖周期，达到治疗肿瘤的目的，本研究将端粒酶PS-ASODN经lipotap脂质体转染作用于子宫内膜癌细胞系HEC-1A，观察其对子宫内膜癌细胞端粒酶活性的影响，同时检测其对子宫内膜癌细胞的生长抑制作用，旨在探讨PS-ASODN对子宫内膜癌的治疗价值，为临床治疗子宫内膜癌提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞 人HEC-1A子宫内膜癌细胞。

2 方法

2.1 实验分组 本实验共分六组，不予正、反义核酸及脂质体的空白对照组，脂质体对照组，1.5 μM端粒酶PS-SODN组和浓度分别为0.5 μM、1.0 μM、1.5 μM 的 PS-ASODN 组。形态学检测和流式细胞仪均采用1.5 μM PS-ASODN。

2.2 实验方法

2.2.1 细胞培养 子宫内膜癌细胞株HEC-1A采用含10%小牛血清的DMEM培养液，在37℃、饱和湿度、含体积分数为5%的CO2培养箱中培养，1～2 d换一次培养液，细胞铺满瓶底70%～80%传代。0.25%的胰蛋白酶分离消化细胞，实验取对数生长期细胞。

2.2.2 MTT检测细胞活性 取各实验组HEC-1A细胞以5×104个/ml浓度接种在96孔板，每孔100 μl，待对数生长期时，实验组分别加入终浓度为 0.5、1.0与 1.5 μM 的 PSASODN，脂质体组加含脂质体的DMEM培养液，对照组加入浓度为1.5 μM的端粒酶PS-SODN，空白对照组仅加DMEM培养液，每组设4个复孔。在全自动酶标仪读取波长570 nm处OD值，计算细胞生长抑制率。

2.2.3 端粒酶活性检测 分别收集各组细胞(约1×106个)，在反应板中分别加入50 μl阴性对照、50 μl阳性对照，50 μl标准液和50 μl各实验组的端粒酶提取物于相应反应板孔中。酶标仪上读取450 nm处OD值。Index=样品的OD值/标准液的OD值。

3 统计学方法

4 结果

4.1 PS-ASODN作用后子宫内膜癌细胞的增殖 如表1显示，端粒酶PS-ASODN组HEC-1A子宫内膜癌细胞增殖减慢，0.5 μM PS-ASODN 组细胞尚能缓慢增殖，1.0 μM PS-ASODN组细胞基本无明显增殖，在48 h到72 h时间段，细胞增殖尤为缓慢。端粒酶PS-SODN组、空白对照组和脂质体对照组HEC-1A细胞随培养时间延长呈指数增长，不受药物影响。

4.2 子宫内膜癌细胞端粒酶活性检测结果 各组细胞转染不同浓度的端粒酶PS-ASODN后，不同时间的端粒酶活性见表2。各浓度组48 h时端粒酶皆表现为阴性，表明PS-ASODN能够抑制端粒酶活性。

表1 各实验组HEC-1A子宫内膜癌细胞体外增殖变化，(A值，，n=4)

表1 各实验组HEC-1A子宫内膜癌细胞体外增殖变化，(A值，，n=4)

注:t检验，各组与对应的空白对照组比较，△P＞0.05、*P＜0.05、＊＊P＜0.01

实验分组0.017脂质体对照 0.256±0.005△ 0.613±0.013△ 0.752±0.013△ 0.793±0.012△PS-SODN 0.252±0.015△ 0.610±0.014△ 0.744±0.020△ 0.777±0.018△0.5 μM PS-ASODN 0.238±0.009* 0.429±0.012* 0.474±0.009＊＊ 0.564±0.011＊＊1.0 μM PS-ASODN 0.228±0.014* 0.380±0.020＊＊ 0.3798±0.011＊＊ 0.485±0.013＊＊1.5 μMPS-ASODN 0.213±0.020* 0.324±0.022＊＊ 0.310±0.022＊＊ 0.392±0.013 24 h 48 h 72 h 96 h空白对照 0.261±0.012 0.628±0.010 0.769±0.021 0.807±＊＊

表2 端粒酶PS-ASODN对HEC-1A子宫内膜癌细胞端粒酶活性的影响(，n=4)

表2 端粒酶PS-ASODN对HEC-1A子宫内膜癌细胞端粒酶活性的影响(，n=4)

注:index≥1为+index在0.91～0.99之间为+/-index≤0.90为-

实验分组培养时间0.047 PS-SODN组 1.296±0.023 1.214±0.039 1.323±0.035 1.317±0.025脂质体对照 1.278±0.045 1.282±0.045 1.327±0.028 1.356±0.036 0.5 μM PS-ASODN 0.988±0.039 0.878±0.022 0.718±0.023 0.762±0.019 1.0 μM PS-ASODN 0.848±0.055 0.817±0.014 0.766±0.014 0.769±0.016 1.5 μM PS-ASODN 0.740±0.025 0.717±0.025 0.696±0.24 h 48 h 72 h 96 h空白对照 1.373±0.036 1.146±0.027 1.269±0.030 1.291±016 0.760±0.032

5 讨论

应用封闭人端粒酶RNA为靶序列的反义寡核苷酸在体内外能明显抑制癌细胞中的端粒酶活性及细胞的增殖［2］，早在1995年，Feng等就用反义hTR转染HeLa细胞，发现细胞中端粒酶活性明显降低，端粒缩短［3］。国内学者用端粒酶反义核酸进行体外试验发现能抑制多种癌细胞的端粒酶活性［4］。此点在本研究同样得到了证实，我们的结果显示子宫内膜癌细胞株HEC-1A细胞中端粒酶活性呈阳性表达，经端粒酶PS-ASODN作用后HEC-1A细胞端粒酶活性受到抑制。而端粒酶PS-SODN对HEC-1A细胞的端粒酶无抑制作用。提示PS-ASODN对细胞端粒酶活性的抑制作用是序列特异性的。

［1］Zamaratski E，Pradeepkumar PI，Chattopadhyaya J.A critical survey of the structure-function of the antisense oligo/RNA heteroduplex as substrate for RNAse H.J Biochenm Biophys Methods，2001，28，48(3):189-208.

［2］Greider CW，Blackburn EH.Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.Cell，1985，43:405-413.

［3］Feng RH，Zhu ZG，Li JF，et al.Inhibition of human telomerase in MKN-45 cell line by antisense hTR expression vector induces cell apoptosis and growth arrest.World J Gastroenterol，2002，8(3):436-400.

［4］MandalM，kumarR，et al.Bcl-2 modulatestelomeraseactevity.Biolchem，2004，272(22):14183.