发酵红皮萝卜中硝酸还原菌的分离筛选*

郭双霜，葛焱，陈安均，3，蒲彪，3，曾骏，付莎莉

1(四川农业大学食品学院，四川 雅安，625014)2(南京旅游职业学院酒店管理系，江苏南京，211100)3(四川省农产品加工及贮藏工程重点实验室，四川雅安，625014)

泡菜是一种传统的大众化发酵食品，因其独特的冷加工方式，有利于保持原料的营养成分、色香味。食用泡菜，除吸收蔬菜的营养成分外，泡菜中的有机酸等，可促进胃肠蠕动，帮助消化，同时可增强机体免疫功能，抑制肠道中腐败细菌的生长。但是，泡菜中亚硝酸盐问题也不可忽视。几乎所有的研究都证实，泡菜在自然发酵过程中硝酸盐含量呈下降趋势，亚硝酸盐含量先升高后下降。具有硝酸盐还原酶的细菌，如大肠杆菌、副大肠杆菌等是使蔬菜产生大量亚硝酸盐的主要因素［1］。从20世纪40年代开始，展开了一项对泡菜发酵过程中自然细菌变化的研究，此研究结果为解释某些类型的泡菜品质差提供了依据。随之出现了大量关于发酵蔬菜中杂菌的研究报道。Fleming等［2］发现发酵过程中肠道菌、总好氧菌和乳酸菌在1～3天内快速生长，并对黄瓜中出现的丁酸腐败菌 Clostridium tertium 进行了研究［3］。何淑玲［4］研究发现，泡菜发酵过程中，泡菜表面微生物的硝酸还原酶的活性与泡菜中亚硝酸盐含量的变化趋势相同，亚硝酸盐的产生是泡菜表面杂菌将硝酸盐还原所致。纪凤娣［5］研究发现，微生物的硝酸还原酶对亚硝峰的形成起主要作用。可见，泡菜在泡菜发酵过程中，亚硝酸盐含量、杂菌总数、泡菜发酵中微生物硝酸还原酶酶活三者存在一定的关系，为此，本文对发酵萝卜中细菌和大肠杆菌数量与亚硝酸盐含量的变化规律进行研究，对其中能还原硝酸盐的菌株进行分离筛选，研究其硝酸还原酶酶活。

1 材料与方法

1.1 实验材料与培养基

红皮萝卜:生姜、辣椒，购自雅安农贸市场。

平板计数琼脂培养基:胰蛋白胨5.0 g，酵母浸出粉2.5 g，葡萄糖1.0 g，琼脂15.0 g，加水溶解后定容至1 000 mL，调 pH 7.0 ±0.1，121℃灭菌15 min。

结晶紫中性红胆盐琼脂培养基:每1 L培养基中加入酵母提取物3 g、蛋白胨7 g、3号胆盐1.5 g、NaCl 5 g、乳糖10 g、中性红 30 mg、结晶紫2 mg、琼脂15 g、pH 7.5，121℃灭菌 15 min。

1.2 方法

1.2.1 泡菜中细菌和大肠杆菌的分离计数

在无菌条件下从发酵泡菜坛中取发酵菜卤10 mL转入90 mL无菌生理盐水(0.85%NaCl)中，制备10－1～10－6的稀释液。用倾注法在培养基上培养计数，于37℃培养箱中培养1 d后计数。待长出明显菌落后，从平板上挑取单菌落，平板划线多次纯化。

1.2.2 发酵初期亚硝酸盐含量的测定

测定0～5 d泡菜中亚硝酸盐的含量。

1.2.3 硝酸盐还原菌株的筛选

将纯化的微生物接种到含有NaNO3的液体培养基中，培养2天后测定NaNO3消耗量和NaNO2含量。

1.2.4 硝酸盐、亚硝酸盐的测定

硝酸盐测定采用紫外分光光度法［6］。称取萝卜匀浆20 g置于250 mL锥形瓶中，加入5 mL氨缓冲液，90 mL蒸馏水，2 g粉末状活性炭，振荡30 min，将样液移入250 mL容量瓶中，加亚铁氰化钾和硫酸锌溶液各2 mL，定容至刻度，摇匀，静置10 min后过滤。取滤液10 mL于50 mL容量瓶中，加入8 g/L氨基磺酸溶液0.1 mL，摇匀，再加入1.0 mol/L HCl 1.0 mL定容至刻度。于紫外分光光度计上测定溶液在220 nm和275 nm处的吸光度。

亚硝酸盐测定采用盐酸萘乙二胺法［7］。称取5g(精确至0.01 g)制成匀浆的试样，置于50 mL烧杯中，加12.5 mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以70℃左右的水约300 mL将试样洗入500 mL容量瓶中，于沸水浴中加热15 min，取出置冷水浴中冷却。加入亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液各5 mL，并加入0.4 g活性碳，用纯水定容至刻度，摇匀。静置30 min后过滤。吸取吸取40 mL上述滤液于50 mL带塞比色管中，加入2 mL对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5 min后各加入1 mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15 min，用2 cm比色皿，以零管调零，于波长538 nm处测吸光度，绘制标准曲线比较。同时做试剂空白。

1.2.5 革兰氏染色

挑取单菌落进行革兰氏染色，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌，细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色(红色)的细菌为革兰氏阴性菌。

1.2.6 接触酶

挑取单菌落直接滴加3%的H2O2，有气泡产生者为接触酶阳性，无气泡为阴性。

1.2.7 菌种的鉴定

以16S rDNA保守序列作为分子标记，引物采用通用引物 27F-1492R，正向 F1:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反 向 F2:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反应体系:上游与下游引物各5 μL，dNTP5 μL，Taq 酶 0.5 μL，10 × PCR buffer 5 μL，加无菌水至50 μL。挑取单菌落为模板加入PCR体系。PCR反应条件为94℃预变性5 min，94℃变性45 s，58 ℃退火 45 s，72 ℃ 延伸 45 s，72℃ 终延伸 10 min，循环30次。4℃保存。取10 μL PCR产物上样进行电泳。电泳缓冲液为0.5×TBE，恒流20 mA电泳40 min。结束后用EB染色15 min，紫外光凝胶成像，进行结果分析。菌株16S rDNAPCR产物测序由北京华大公司完成，测序结果与Genbank的序列进行比对。

1.2.8 硝酸盐还原菌中硝酸还原酶活力测定［8］

菌体制备:将硝酸盐还原菌接种于液体培养基中，于培养箱中37℃培养18 h。菌液离心(5 000×g，4℃，25 min)，弃去上清液，得到下面的沉淀，即菌体。

粗酶液的提取:菌体中加入20mL提取缓冲液(5 mmol/L EDTA，5 mmol/L半胱氨酸，25 mmol/L的磷酸缓冲液，pH 7.6)，超声波破碎，离心，上清液即为粗酶提取液。

酶活力的测定:取 2 mL粗酶提取液，1 mL NaNO3(100 mmol/L)，6 mL磷酸钾缓冲液(100 mmol/L，pH 7)混合，再加入1 mL的新配制的NADH溶液(2 mg/mL)。30℃反应30 min。将分析液移入沸腾的5 mL 0.3 mol/L的ZnSO4溶液中，煮沸1 min，然后冷却至室温。加入2 mL l mol/L的NaOH，室温下离心。取3 mL上清液，加入3 mL磺胺(1%)配置于3 mol/L HCl)和3 mL 0.05%(m/V)的N-1萘基乙二胺溶液。3℃下静置30 min。于波长540 nm处测吸光度，和标准曲线对照得出亚硝酸盐浓度。由此得到的亚硝酸盐浓度换算成硝酸还原酶活性大小。

1.2.9 pH对酶活力的影响

将酶液分别与0.1 mol/L，pH 3.0～7.5的磷酸缓冲液等量混合，测定酶活。

2 结果与分析

2.1 细菌和大肠杆菌与亚硝酸盐的变化

采用平板计数培养基和结晶紫中性红胆盐培养基对发酵泡菜中细菌和大肠杆菌进行计数。如图1所示，在发酵过程中，细菌数量第2天就达到了107CFU/mL，大肠杆菌达到了104CFU/mL，此时亚硝酸盐的含量也最高，随着发酵的进行，亚硝酸盐含量逐渐下降，细菌和大肠杆菌的数量也逐渐减少。

图1 发酵初期细菌和大肠杆菌数量与亚硝酸盐的变化

2.2 硝酸盐还原菌的筛选及还原能力测定

采用2种不同培养基从发酵萝卜中分离出10个菌株，对它们进行还原能力测定。如图2、图3所示，9个液体培养基中硝酸盐含量减少，亚硝酸盐含量增加，说明接种的9个菌株都具有硝酸盐还原能力，其中E5、E6硝酸盐还原能力最强，其次是D1、D2。D3无硝酸盐还原能力。因此选择E5、E6作后续实验。

图2 各菌株亚硝酸盐生成量

图3 各菌株剩余的硝酸盐含量

2.3 菌落形态分析

从发酵萝卜中筛选出2个硝酸盐还原能力较强的菌株E5、E6。经分离纯化后，观察平板上的菌落形态见图4，菌落特征见表1。

表1 E5、E6的菌落形态

图4 E5和E6的菌落形态

2.4 革兰氏染色

对分离的2株硝酸盐还原菌进行革兰氏染色，光学显微镜下观察菌体的形态特征见图5，两者均为革兰氏阴性菌。

图5 E5(左)和E6(右)菌体形态特征及革兰氏染色(10×100)

2.5 接触酶

E5和E6滴加H2O2后不产生气泡，接触酶反应均为阴性。

2.6 分子生物学鉴定

E5与E6号菌株的16SrDNA序列测定结果与GenBank中的序列比对并进行同源性分析和系统发育树构建，表明E5(HM162426.1)与阴沟肠杆菌同源性最高，相似度为98%，E6(GQ496663.1)与克雷伯氏菌同源性最高，相似度为97%。

图6 根据16S rDNA序列绘制的系统发育树

图7 根据16S rDNA序列绘制的系统发育树

结合E5与E6的菌落形态、菌体特性、革兰氏染色及接触酶反应，最终确定2株菌分别为Enterobacter cloacae和 Klebsiella oxytoca。

2.7 硝酸还原酶活的测定

菌株E5、E6的硝酸还原酶活力分别为1.64和1.79。

2.8 pH值对硝酸还原酶的影响

由图8可知，随着pH的增大，硝酸还原酶酶活逐渐增大，pH 3～4.5时酶活比较低，pH 5～6.5酶活较高，pH 5.5时酶活最高。因此，pH 5.5为硝酸还原酶的最适pH。Klebsiella oxytoca硝酸还原酶活力比Enterobacter cloacae高。

图8 pH对硝酸还原酶的影响

3 结论

通过分析亚硝酸盐含量与细菌、大肠杆菌数量的变化，发现亚硝酸盐含量、细菌、大肠杆菌的变化趋势基本一致，亚硝峰出现在发酵的第2天，此时细菌和大肠杆菌数量分别达到了107CFU/mL和104CFU/mL。随着发酵的进行，亚硝酸盐含量和细菌、大肠杆菌数量逐渐减少。这可能与微生物中硝酸还原酶有关。目前，对于蔬菜发酵过程中亚硝酸盐的形成，大多数人认为起作用的是具有硝酸盐还原能力的微生物，少部分人认为是蔬菜组织中硝酸还原酶将硝酸盐还原为亚硝酸盐引起的。关于亚硝酸盐形成的原因还有待进一步的研究。

硝酸盐还原对于整个氮素循环极为关键。从发酵萝卜中分离出9个菌株均具有硝酸盐还原能力，其中2个菌株有较高的硝酸盐还原能力，经分子生物学鉴定，分别为Enterobacter cloacae和Klebsiella oxytoca。

经过对不同pH条件下硝酸还原酶活性的研究，确定pH 5.5为2个菌株硝酸还原酶的最适pH。随着发酵的进行，发酵液pH逐渐降低，亚硝酸盐含量也逐渐减少，有研究发现pH 4.5以下能够抑制硝酸还原酶酶活，抑制了亚硝酸盐的生成［5］。Klebsiella oxytoca硝酸还原酶酶活力高于Enterobacter cloacae。说明Klebsiella oxytoca硝酸盐还原能力比Enterobacter cloacae强。

［1］郑琳，王向明，张娟.影响甘蓝泡菜中亚硝酸盐含量因素的研究［J］.中国调味品，2005，3(3):26－29.

［2］Fleming H P，McFeeters R F.A fermentor for study of sauerkraut fermentation［J］.Biotechnology Bioengineering，1988，31(3):189－197.

［3］Fleming H P，Daeschel M A，McFeeters R F，et al.Butyric acid populations during initiation of Cucumber fermentation［J］.Journal of Food Science，1989，54:636－639.

［4］何淑玲.泡菜发酵过程中亚硝酸盐生成和降解机理的研究［D］.北京:中国农业大学，2006.

［5］纪凤娣.蔬菜发酵过程中微生物变化和亚硝酸盐形成降解规律研究［D］.北京:中国农业大学，2007.

［6］冷家峰，刘仙娜，王泽俊.紫外吸光光度法测定蔬菜鲜样中硝酸盐氮［J］.理化检验，2004，5(40):288－289.

［7］GB/T 15401－1994.水果、蔬菜及其制品亚硝酸盐和硝酸盐含量的测定［S］.

［8］Dodds K L，Collins-Thompson D L.Incidence of nitritedepleting lactic acid bacteria in cured meats starter cultures［J］.Journal of Food Protection，1984，47(1):7－10.