混合树脂吸附两性霉素B杂质比例研究

付蕴敏

（上海新亚药业有限公司新先锋制药厂，上海201203）

0 引言

两性霉素B为多烯类抗真菌抗生素，临床上用于治疗深部真菌引起的内脏或全身感染，该药物已有50余年的历史。近年来，随着广谱抗菌素和皮质激素的广泛应用，肿瘤和化疗病人的增多，介入治疗和深静脉置管技术的开展，真菌深部感染的发生率大幅度上升。两性霉素B因其抗菌谱广、疗效确切，在临床上有不可替代的价值。

大孔吸附树脂是一类不含交换基团，且具有大孔网状结构的高分子吸附树脂，具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、再生处理方便等优点，已广泛应用于药物成分的提取、分离、纯化工作中。传统的两性霉素B原料药纯化工艺要经过多次重复结晶才能达到质量要求，收率低、周期长、成本高。本方法是将此大孔树脂吸附技术运用于两性霉素B纯化过程，将2种不同的树脂按最佳比例混合起来，有选择性地吸附两性霉素B溶解液中的杂质来纯化两性霉素B，提高两性霉素B原料的质量。

1 材料与仪器设备

上海华震科技有限公司大孔树脂型号：D832和D816；两性霉素B，上海新亚药业有限公司；600mm×50mm层析柱，国药试剂仪器有限公司；高效液相色谱仪，Agilent1100；YZ156恒流泵，保定兰格恒流泵有限公司；磁力搅拌器，国药试剂仪器有限公司；恒温水浴锅，国药试剂仪器有限公司；DMF、乙醇、甲醇、丙酮等试剂均为工业级。

2 方法与结果

2.1 分析方法（HPLC法两性霉素B含量测定）

仪器：高效液相色谱仪，Agilent1100。

流动相A：乙腈—甲醇—含0.073%乙二胺四乙酸的0.05 mol/L醋酸铵溶液（用冰醋酸调节pH值至5.0）（260:450:320）；流动相B：乙腈—甲醇（260:450）；检测波长：405 nm；流速：1.0m L/m in；进样量：20μL。

取供试品溶液10m L，加0.01mol/L盐酸溶液100μL，置60℃水浴加热10m in，冷却后，取1m L，置10m L容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，注入色谱仪，记录色谱图，在两性霉素B峰的相对保留主峰时间约为0.6倍处有一杂质峰，理论板数按两性霉素B峰计算不低于3 000。

先以流动相A洗脱，待两性霉素B洗脱后，再按表1进行线性梯度洗脱。精密量取对照溶液注入色谱仪，调节检测灵敏度，使主峰高约为满量程的25%。

表1 梯度洗脱表

供试品溶液制备：取供试品25 mg，精密称定，置50m L棕色容量瓶中，缓慢滴加二甲基亚砜（DMSO）并旋摇，使其均匀地分散在DMSO中，再加DMSO使其溶解并稀释至刻度。精密量取2m L，置50 m L棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。制备1份，进样1针。

对照溶液制备：精密量取供试品溶液2 m L，置100m L棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。制备1份，进样2针，RSD≤5.0%。

精密量取供试品溶液和对照溶液，分别注入色谱仪，记录色谱图。

计算如下：

表2 第一次混合树脂过柱条件及结果

2.2 实验方法

装柱：不同比例的2种树脂，湿法装柱300 m L至600 mm×50 mm层析柱，柱内保留过树脂层10 cm的pH为3.8～4.2的流动相吸附过程备用。

样品溶解：将10 g两性霉素B置于比例为1:2的DMF和甲醇混合溶剂中，调pH至4.5，以50 r/min搅拌溶解，将溶解好的溶液放入18～20℃的恒温水浴锅中，保温备用。

吸附：将保温后的两性霉素B溶液（18～23℃），用恒流泵以15m L/min的速率注入层析柱内，10m L/m in的溶液速率过树脂柱，总过柱时间为65～70m in，柱内流动相控制为pH至3.5～5.0。

2.3 实验过程和结果

2.3.1 第一次混合比例树脂过柱

以10 g两性霉素B为溶解量，总树脂量300m L，并分别以D832和D816 2种树脂混合比例为3:7、4:6、5:5、6:4、7:3，在两性霉素B溶解温度为18～20℃、柱内流动相pH为3.8～4.2条件下，以10m L/m in的过柱速率吸附溶解液中的杂质。

2.3.2 第一次混合树脂过柱条件及结果

第一次混合树脂过柱条件及结果如表2所示，第一次过柱后有关物质曲线图如图1所示。从第一次混合比例树脂结果数据及图表可以看出，在其他吸附条件相同的条件下，当树脂混合比例趋向于D832:D816为4:6时，树脂吸附两性霉素B杂质的效果最优，产物最大单杂为1.59%，总杂为6.29%。因此，以D832:D816比例为4:6基础进行最佳吸附树脂比例的细化研究。

2.3.3 第二次混合比例树脂过柱

以10 g两性霉素B为溶解量，总树脂量300m L，并分别以D832和D816两种树脂混合比例为3.4:6.6、3.6:6.4、3.8:6.2、4.0:6.0、4.2:5.8、4.4:5.6、4.6:5.8，在两性霉素B溶解温度为18～20℃，柱内流动相pH为3.8～4.2条件下，以10m L/m in的过柱速率吸附溶解液中的杂质。

2.3.4 第二次混合树脂过柱条件及结果

第二次混合树脂过柱条件及结果如表3所示，第二次过柱后有关物质曲线图如图2所示。第二次混合比例树脂过柱结果表明在D832：D816树脂比为3.6:6.4的情况下，树脂对两性霉素B杂质的吸附效果最好，最大单杂为1.45，总杂为5.60，较其他比例的混合树脂吸附杂质效果更加显著。

表3 第二次混合树脂过柱条件及结果

3 结语

利用不同极性的大孔树脂对两性霉素B杂质的特异性吸附作用，将不同种类的树脂按最佳比例混合起来，有选择性地吸附两性霉素B溶解液中的杂质，此方法显著地降低了两性霉素B的有关物质，在很大程度上提高了两性霉素B原料的质量。

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