鹿花盘营养成分及蛋白多肽提取工艺的研究进展

黄彬彬，赵 越，徐 峰，杨 柳，刘 磊，南璐璐，陈思瑶综述，葛红娟审校

(吉林医药学院：1.护理学院，2.临床医学院，3.营养教研室，吉林 吉林 132013)

·综 述·

鹿花盘营养成分及蛋白多肽提取工艺的研究进展

Researchprogressonapproximatecompositionsandextractionofpolypeptideofdeercoronet

黄彬彬1，赵 越1，徐 峰1，杨 柳1，刘 磊2，南璐璐1，陈思瑶2综述，葛红娟3*审校

(吉林医药学院：1.护理学院，2.临床医学院，3.营养教研室，吉林 吉林 132013)

鹿花盘是一种成分丰富的具有较高药用价值的动物性中药材，其中含有蛋白质多肽、氨基酸、胆固醇、多糖、脂类和无机物与矿物质等，其中丰富的蛋白质和多肽是鹿花盘主要的药效成分。本文对其营养成分和近年来鹿花盘蛋白质多肽的提取工艺进行了综述。

鹿花盘；营养成分；蛋白质、多肽、氨基酸；提取工艺

鹿花盘别名“花盘”、“角盘”、“珍珠盘”、“鹿角盘”[1]，是鹿科动物的角冠和残留的角根于翌年新茸萌发时自然脱落的部分。鹿花盘中含有蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、胆固醇和磷脂酰胆碱等，并含大量的钙、磷及锌、铁、锰、铜等微量元素，其中丰富的蛋白质是鹿角盘主要的药效成分[2]。近年来关于鹿花盘的研究多集中在鹿花盘蛋白多肽的活性成分分析以及药理作用的研究。在研究过程中有关鹿花盘蛋白的提取方法主要有分子筛层析、酶解法、盐提法。鹿花盘多肽的提取方法有盐析、高压辅助提取、热回流浸提法、分子筛层析。本文对其化学成分和近年来鹿花盘蛋白质多肽的提取工艺进行了综述。

1 营养成分

1.1蛋白质和多肽

蛋白质和多肽是鹿花盘主要的活性成分，人们对其研究报道比较多。王志兵等[3]采用酶水解提取，并通过Folin酚法和水合茚三酮法鉴定，得到分子质量在8 000～15 000之间的鹿花盘蛋白多肽。王艳梅等[4]采用80%甲醇提取并配合柱层析分离,得到2种相对分子质量为395.1和691.1的鹿花盘小分子肽，且后者是主要成分；同时，对鹿茸和鹿花盘多肽进行电泳比较，结果发现鹿茸中有2条多肽带，而鹿花盘中只有1条。唐任能等[5]通过电泳法比较了鹿茸、鹿花盘和鹿骨中水溶性总蛋白。结果表明，鹿花盘有11条带，鹿茸8条带，而鹿骨几乎无明显可见的条带。这个结果说明，鹿茸、鹿花盘和鹿骨中总蛋白组成及含量有明显差异。田玉华等[6]采用凯氏定氮法测定鹿花盘中粗蛋白，采用二唆琳甲酸(BCA)法测定水溶性蛋白质。结果表明，粗蛋白含量为32.8%，水溶性蛋白质含量为8.29%。幺宝金等[7]研究发现，鹿花盘蛋白质多为酸性蛋白质。苏凤艳等[8]采用盐提、热处理及凝胶过滤分离梅花鹿花盘蛋白质，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)初步证实鹿花盘是由5种分子质量在10 000～70 000的蛋白质组成的混合物。邱芳萍等[9]通过分子筛层析、酶解等技术分离纯化得到1种分子质量在20 100～31 000之间的鹿花盘蛋白。

1.2氨基酸

鹿花盘中氨基酸含量高且种类十分丰富。李泽鸿等[10]通过比较梅花鹿不同产品中的氨基酸含量，发现鹿花盘中各种氨基酸的总量为33.5%，必需氨基酸含量为10.6%，低于鹿茸但高于鹿角。王丽虹等利用KJA-5型氨基酸自动分析仪对采用分子筛方法制备的鹿花盘水溶性成分进行了测定，结果表明，其中含有15种氨基酸。张宝香等[11]采用KJA-5型氨基酸自动分析仪对鹿花盘的测定。结果表明，鹿花盘中含有16种氨基酸，与王丽虹等人的测定结果相比多了色氨酸。苏凤艳等[8]采用盐提、热处理及凝胶过滤法提取鹿花盘总蛋白，并通过835-50型氨基酸自动分析仪对其进行了测定。结果表明，其中含有17种氨基酸，比吉村寿等人报道的鹿花盘水溶性成分中氨基酸种类多了半胱氨酸和缬氨酸。以上测定结果中氨基酸种类的不同，可能是因为采用的提取方法不能提取出所有种类的鹿花盘蛋白，因而造成了氨基酸组成的差异。

1.3胆固醇

王芳等[12]采用高效液相色谱法检测了鹿脱盘中胆固醇的含量，并建立了鹿脱盘品质的质量评价标准和方法，可为鹿脱盘资源的进一步开发利用提供科学依据。

1.4多 糖

天然多糖是一类无毒、无害、具有生理活性的高分子化合物，尤其作为免疫治疗药物越来越受到重视，已成为新药开发和保健品的研究热点。田玉华等[6]采用3，5-二硝基水杨酸法测定鹿花盘中还原糖、总糖含量，采用苯酚硫酸法测定可溶性糖含量。结果表明，鹿花盘中总糖含量为1.68%，还原糖含量为0.58%，可溶性糖含量为1.14%。

1.5脂 类

人们对鹿花盘中脂类的研究较少，尤其对具有较强生物活性的不饱和脂肪酸种类的研究更加缺乏。田玉华等[6]利用索氏提取法对鹿花盘中粗脂肪含量进行了测定，采用氢氧化钠滴定法、分光光度法分别对游离脂肪酸和磷脂含量进行了测定。结果表明，粗脂肪含量为1.91%，游离脂肪酸含量0.067%，磷脂含量0.30%。王芳等[12]通过高效液相色谱分析鹿花盘胆固醇含量。结果表明，含量很低，约为0.224 μg/g。

1.6无机物与矿物质

元素的含量及存在的状态与中药药理作用密切相关。鹿花盘中的无机元素种类多且含量随鹿龄的改变而变化。田玉华等[6]采用灰化法测定鹿花盘中无机物含量为58.14%，利用AA-6300型原子吸收分光光度计测定了钙、磷、钠、镁、铁、锌、锰7种矿物元素。结果表明，钙、磷含量分别达10.7%和11.23%。姚玉霞等[13]测定结果表明，鹿花盘中钙、磷含量分别达7.71%和7.47%。由此可见，鹿花盘中钙、磷含量非常高，这与其骨化特征相一致。张宝香等采用原子吸收分光光度法测定了鹿花盘中的钙、磷、镁、钠、钾、铁、锰、锌、铝、锶、钡11种元素,结果发现，钙、磷、钾、锌及铝的含量随鹿龄的增长而增加，铁含量不受年龄影响。刘佳佳等[14]采用火焰原子吸收光谱法测定了不同鹿龄梅花鹿花盘矿质元素锌、铜、锰和铁4种元素的含量。结果表明，所测样品中4种元素含量都很丰富，且各元素含量的变化与鹿龄有关，其中锌含量随着鹿龄的增加而减少，铜和铁含量随着鹿龄的增加而增加，3岁鹿花盘中锰含量最高，其他年龄鹿花盘中锰含量差异不明显(P>0.05)。此结论与张宝香等人的测定结果相悖，说明鹿花盘中无机元素含量随鹿龄的变化规律还需进一步研究。

2 鹿花盘的蛋白质提取工艺

2.1分子筛层析

邱芳萍等[9]通过超微粉碎技术使坚硬的鹿花盘粉碎,再运用生物化学技术，经过浸提、盐析、透析、分子筛层析等生物技术，分离纯化出一种鹿花盘蛋白APPB，然后通过动物实验考察其活性作用。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测其分子质量在20 100～31 000之间。苏凤艳等[8]将鹿花盘粉末先用1% NaCl和0.05 mol/L HCl溶液浸泡1 h，过滤，流水透析24 h。然后75 ℃热变性3 min，4 000 r/min离心20 min，弃去沉淀取上清液进行浓缩，用Sephdex G-50柱层析后用0.6% NaCl溶液洗脱，收集双缩脲反应阳性部分，浓缩后即得到鹿花盘蛋白。马广丽等[15]同样采用盐提、热变性处理及凝胶过滤法从鹿茸、鹿花盘粉中提取蛋白质。该方法提取分离的鹿花盘蛋白质，经SDS-PAGE法初步证实鹿花盘蛋白质是由5种分子量在10 000～70 000的蛋白质组成的混合物；氨基酸分析表明,鹿花盘蛋白质含有17种氨基酸,比先前相关文献[16]报道的鹿花盘水溶性成分氨基酸的种类多1种，因此该方法为鹿花盘蛋白质的提取和氨基酸种类的鉴定提供新的依据。

2.2酶解法

张鹤[17]在研究鹿花盘胶原蛋白质制备及治疗骨质疏松症作用研究的过程中，提取鹿角脱盘胶原蛋白，并研究料液比(鹿角脱盘∶水)、水煮时间、提取次数、胰蛋白酶与底物比、酶解时间对鹿角脱盘明胶提取的影响，确定了提取胶原蛋白的方法为：称取10 g鹿角脱盘粉3份，按料液比1∶5，每次水煮5 h，提取4次，离心，合并上清液。按酶与底物比为1∶10 000酶解1.5 h，加热使酶失活，浓缩样品，置于-20 ℃预冻，冻干得到鹿角脱盘胶原蛋白。采用热水浸提与酶解法相结合，在料液比1∶5，水煮5 h，提取4次，胰蛋白酶与底物比1∶10 000酶解1.5 h，得到鹿角脱盘胶原蛋白的收率为22.31%，平均蛋白含量为66.32%。具体流程为：鹿花盘粉末按料液比1∶5加蒸馏水，提取4次，每次5 h，水提液4 000 r/min离心30 min,合并上清液，加胰蛋白酶，37 ℃酶解1.5 h，酶解液4 000 r/min离心30 min,0.45 μm滤膜过滤，滤液-20 ℃预冻,冻干得到鹿花盘胶原蛋白。采用胰蛋白酶制备鹿骨胶原蛋白和鹿角脱盘胶原蛋白，条件温和，反应时间短，水解后的相对分子质量较小，易于人体吸收利用；建立了一条快速、简单、高效的提取工艺路线，易于实现工业生产。

2.3盐提法

幺宝金等[7]为建立鹿角脱盘蛋白提取工艺采用SDS-PAGE，考察不同pH值、不同料液比、不同浸提时间、不同盐浓度等影响因素对蛋白提取效果的影响。最后得到鹿角脱盘蛋白的提取工艺:pH值12的缓冲液(含50 mmol/L EDTA、0.5mol/L NaCl)浸提，料液比为1∶5，浸提时间为3 h,浸提次数2次。验证实验结果表明,鹿角脱盘总蛋白收率可达2%,纯度可达80%。黄萍等[18]以总蛋白得率为评价指标，采用单因素试验和正交试验设计优选最佳提取工艺。得出最佳提取工艺为:用含0.3 mol/L NaCl，20 mmol/L Na2HPO4缓冲液(pH值为9)提取，料液比为1∶15。采用该提取分离工艺可获得较高的蛋白收率和纯度，是一种快速、简单、高效的鹿角托盘水溶性总蛋白提取工艺，这为鹿角托盘水溶性蛋白更深入的研究与开发奠定了基础。

3 鹿花盘的多肽提取工艺

3.1盐 析

王志兵等[3]以鹿花盘为原料,经过水浴、过滤、盐析和离心等步骤进行提取,再采用中性甲醛滴定进行水解，然后进行纯化，方法为将水解液装入透析袋(截流分子质量8 000～15 000)中，用蒸馏水于4 ℃冰箱中透析3 d，24 h换一次水。将外透析液用旋转蒸发仪浓缩，并将浓缩液冷冻干燥,即得鹿花盘蛋白多肽样品。此方法温度系数小，溶解度大，应用范围广，而且成本低廉，对多肽有保护作用，重复性好。但是其提纯的蛋白质浓度不高，只用于初步纯化。

3.2高压辅助提取

于文影[2]在采用高压辅助提取法提取蛋白过程中，研究压力、时间、料液比对蛋白质提率的影响。以压力(A)、提取时间(B)、料液比(C)三个因素作为实验因子做高压辅助提取的正交优化实验。结果表明对提取率影响最大的是料液比，然后是压力和提取时间。最优提取工艺组合压力值为0.10 MPa，提取时间为15 min，料液比为1∶5。在上述条件下提取，提取率为92.03%。与传统的蛋白质提取方法相比，高压辅助提取法具有操作工艺简单易控制，产品无小分子盐渗入，生产周期短，生产环保无污染的优点。

3.3热回流浸提法

王志兵等[3]以鹿花盘为试验原料,以鹿花盘水溶性成分总氮含量为考察对象,通过热回流浸提法、超声波提取法、高压脉冲电场提取法提取鹿花盘水溶性成分。结果得出，热回流浸提法为最佳提取方法，并通过正交试验优化其提取的最佳工艺条件为温度90 ℃、料液比1∶30、提取次数2次、提取时间60 min;高压脉冲电场提取法最佳工艺条件为电场强度50 kV/cm、脉冲数30、温度20 ℃、料液比为1∶20。热回流浸提法作为比较成熟的提取方法，广泛应用于提取加工，它具有设备简单、可以工业化放大等优点，但同时破坏热敏性物质,高能耗、费时，在当今追求低温、低能耗、省时的大趋势下，热回流浸提法已经不能满足现代化提取技术的需要。

3.4分子筛层析

黄凤杰等[19]以鹿角脱盘为原材料，经稀醋酸提取，再利用离子交换柱层析、凝胶柱层析、反相柱层析进一步纯化和质谱检测确定其Mr为712 716的多肽，命名为鹿角脱盘多肽。王丽虹等[20]用分子筛制备的鹿花盘水溶性成分经双缩脲试验为淡紫色，茚三酮反应为蓝紫色，证明其水溶性成分中含有多肽和氨基酸。通过用KJA-5型氨基酸自动分析仪测定含有15种氨基酸。制备的多肽成分经双缩脲反应为阳性，茚三酮反应为阴性。经紫外光谱检查在270～279 nm处为最高吸收峰。红外检测也有明显的氨基酸和多肽成分的特征。王振玉等[21]采用水煎煮提取胶体物质，再经过透析或超滤分离，从中分离出有活性作用的16种氨基酸组成的小分子多肽。具体方法为：

1.样品制备。取鹿花盘250 g经透析分离后减压浓缩至15 mL，置于真空干燥箱中70 ℃，干燥4 h取出提取物备用。

2.葡聚糖凝胶G-25层析柱制备。Sephadex G-25(粒度50～150)，分子量分级范围(肽及球蛋白)1 000～5 000之间加入适量蒸馏水使之充分膨胀后，置于(980×25 mm)玻璃层析柱中，用0.02 mol/L NaCl洗脱平衡。

3.层析分离：将上述提取物加入Sephadex G-25层析柱顶端，样品进柱后，用0.02 mol/L NaCl洗脱，洗脱速度0.5 mL/min，分布收集，分别检验各管洗脱液的多肽和氨基酸，双缩脲反应阳性为多肽成分，双缩脲反应而茚三酮反应阳性为氨基酸成分。该方法应用范围广且设备简单、操作方便、复性高、不影响分子的生物学活性等。但其分辨率不高，分离操作较慢，由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，所以分离时必须严格把握流速。因而分离操作一般较慢。而且对于分子量差别不大的物质难以达到很好的分离。此外，凝胶层析要求样品粘度不宜太高，凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象。

4 展 望

综上所述，可以用很多不同的方法如：分子筛层析、酶解法、SDS-PAGE等从鹿花盘中提取蛋白质和多肽。随着现代科技手段及实验技术的发展，鹿花盘中蛋白质、多肽可以利用高科技方法提纯，这些方法虽可提高鹿花盘中蛋白质和多肽利用率，并且对鹿花盘的进一步开发有着极为重要的意义，但其价格较高，操作较复杂，用时较长，因此探求简便、廉价的鹿花盘蛋白质、多肽的提取方法有着极大的经济及现实意义。

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1673-2995(2013)04-0305-04

S865.4+2

A

吉林医药学院大学生科研基金资助项目(201211).

黄彬彬(1990-)，女(汉族)，在读本科.

葛红娟(1985-)，女(汉族)，助理实验师,本科.

2012-12-06)