水貂干扰素-β基因的克隆与序列分析

杨培培 衣服德 冯永胜 张 倩 （山东省青岛市畜牧兽医研究所 266100）

干扰素(interferon，IFN)是一类高活性多功能的糖蛋白，根据对其基因核酸序列分析结果表明，它于5～10亿年前即于生物学细胞中存在，是生物体内一类古老的保护因子[1]。IFN具有很高的生物学活性，其比活性为108个IU/mg蛋白质，抗病毒作用无特异性，是广谱抗病毒物质。目前，IFN在临床中的使用愈来愈普遍，治疗效果也比抗病毒药物要好[2]。

山东省是水貂养殖大省，近年来，随着水貂养殖业规模的不断扩大，毛皮动物主要传染病流行严重，发病率和死亡率居高不下，造成了巨大的经济损失。特别是水貂犬瘟热、水貂细小病毒性肠炎、水貂阿留申病等严重威胁水貂养殖业的发展。

动物体内自身产生的干扰素极其微量，利用基因工程技术生产重组干扰素是获得干扰素的一条有效途径。本试验从水貂肝脏组织中提取基因组DNA，扩增出水貂IFN-β基因，并对其进行序列分析，为重组水貂IFN-β类生物制剂的研制和开发奠定了基础，同时为更好的控制水貂病毒性疫病提供资料。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜水貂肝脏组织采自于山东诸城某养貂场。pMD18-T为TaKaRa产品，大肠埃希菌DH5α由本实验室保存，引物合成和全自动测序由大连宝生物工程有限公司完成。PCR仪、质粒提取试剂盒、Taq酶、DNA凝胶回收试剂盒、6×DNA上样缓冲液、Marker E、goldview核酸染料为赛百盛产品。

1.2 方法

1.2.1 水貂肝脏组织基因组的提取 切取水貂肝脏组织5g左右，剔除结缔组织，吸水纸吸干血液，剪碎放入研钵(越细越好)，加入液氮，磨成粉末，加5ml生理盐水充分混匀，3000rpm离心5min，将上清400μl收毒入Eppendorf管，加入8μl蛋白酶K(20mg/ml)和92μl细胞消化裂解液，52℃作用8h后，每管加入500μl酚/氯仿进行抽提，12000rpm离心15min，然后将上清转移到一新的Eppendorf管中(若蛋白量大则再用酚氯仿抽提一次)。再加入上清2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀1h，12000rpm离心15min，弃上清，用70%乙醇400μl洗涤沉淀，待酒精挥发干燥后加适量TE溶解，置-20℃保存备用。

1.2.2 水貂IFN-β基因引物的设计和合成 根据Genbank已发表的水貂IFN-β基因序列，设计一对特异性引物，用于扩增IFN-β基因，预期扩增产物大小约为561bp。引物由大连宝生物工程有限公司合成，用ddH2O水稀释到20pmol/µl，-20℃保存备用。

1.2.3 水貂IFN-β基因的PCR扩增 以提取的水貂肝脏组织DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25ml，反应程序为：95℃5min；94℃1min，51～62℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min。对PCR反应条件进行摸索。取5μlPCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像系统观察结果。鉴定正确后将剩余样品全部进行琼脂糖凝胶电泳，用回收试剂盒进行纯化回收。

1.2.4 水貂IFN-β基因的克隆与鉴定 将胶回收产物与pMD18-T载体连接，连接产物转化至 E.coli DH5α感受态细胞，试剂盒提取重组质粒DNA，以 PCR鉴定和EcoRⅠ及SalⅠ双酶切鉴定重组质粒。

1.2.5 IFN-β全基因的序列测定及分析 将鉴定为阳性的重组质粒送大连宝生物工程有限公司测序，利用DNAstar6.0 MegAlign软件，将所测定的IFN-β基因的核苷酸序列与GenBank已收录的序列进行比对分析。将测序确定为阳性的质粒命名为pMD18-IFN-β。

2 结果

2.1 目的基因片段的PCR扩增结果

设定梯度温度51～62℃退火，进行PCR扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后可观察到在51℃时出现特异性条带，长度约为561bp，与预期结果相符，所以51℃为退火温度。如图1所示：

图1 梯度PCR电泳结果

2.2 重组质粒的PCR鉴定及酶切鉴定

2.2.1 PCR鉴定结果 将含有IFN-β基因的重组质粒进行PCR鉴定，在561bp处出现特异性条带，如图2所示。

图2 重组质粒的PCR扩增结果

图3 重组质粒双酶切鉴定

2.2.2 酶切鉴定结果 重组质粒经EcoRI和SalⅠ双酶切后得到约1000bp和约2250bp的片段，与预期结果相符，由此证明了目的基因已插入到pMD18-T载体中，重组质粒构建成功，结果见图3。

2.3 IFN-β测序结果

取含阳性重组质粒的菌落，培养后的菌液由大连宝生物工程有限公司进行测序。采用DNASTAR软件将该基因序列与Genbank上的水貂IFN-β基因的DNA序列进行同源性比较，结果所克隆到的水貂IFN-β基因全长56lbp，编码186个氨基酸，核甘酸序列同源性为100%。

2.4 同源性比较

试验扩增出的基因片段全长为561bp，共编码186个氨基酸。本试验结果扩增出的水貂IFN-β与GneBnak上已公布的人类的INF-β基因相比较，核苷酸序列同源性为34.06%，与鼠的同源性为37.60%，与犬的同源性为99.15%，与鼬的同源性为99.64%。将扩增的IFN-β基因序列与从Genbank数据库中获取的其他种属INF-β基因序列进行系统进化树分析，结果见图4。

图4 IFN-β基因系统发育分析结果

3 讨论

上世纪30年代，人们发现机体感染某一病毒后，会对另一种抗原性毫无关系的病毒发生干扰现象。直到1957年，Isaacs和Lindenmann利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时才了解到病毒感染的细胞能产生一种因子，作用于其它细胞，干扰感染病毒的复制，因而命名为干扰素(interferon，IFN)[3]。由于干扰素具有调节机体体液免疫反应和细胞免疫反应，增强机体对细菌、寄生虫和病毒感染的抵抗力等重要作用，所以对其研究一直是细胞因子研究方面的重点之一。1994年，Sekellick等首次成功克隆和表达chIFN-α基因并进行结构分析[4]，1995年Digby等又成功地克隆了鸡IFN-γ基因[5]。干扰素是第一个在分子水平上进行研究的细胞因子，其经验很快用于其他细胞因子的研究，并获得了巨大的进展，促进了新药开发和分子生物学学科的发展。

目前关于水貂INF-β的研究报道比较少，对β干扰素克隆及表达方面的研究，还没有相关文章报道。通过本研究，对水貂一些疾病如水貂犬瘟热、水貂细小病毒性肠炎、水貂阿留申病的预防有指导性意义。另外，少量干扰素即可延迟和减少病毒的增殖，大量干扰素则可阻止病毒的复制。动物体内自身产生的干扰素极其微量，以传统的方法难以制备和纯化，因此利用基因工程技术生产重组干扰素是解决这一难题的有效途径。在我国干扰素研究起步较晚，而我国水貂养殖业发展迅速，干扰素对控制水貂病毒性疫病又具有很好的预防作用，因此对水貂干扰素的研究具有重要意义。

有关研究表明，干扰素的保护作用具有相对的种属特异性，如家禽产生的干扰素只能保护家禽，不能保护其它动物。本试验所克隆的IFN-β基因序列与Genbank上公布的水貂IFN-β基因序列同源性为100%，与GneBnak上已公布的人类的INF-β基因序列同源性为34.06%，与鼠的同源性为37.60%，与犬的同源性为99.15%，与鼬的同源性为99.64%。试验结果说明，不同种属动物产生的干扰素在基因水平上存在一定差异，这与上述研究结果一致。本研究首次从水貂肝脏组织中克隆得到干扰素β基因，所克隆的基因在同属动物中高度保守，为进一步原核表达和研制重组干扰素制剂提供前提条件。

[1] 郭小权, 谌南辉. 干扰素的研究进展[J]. 广西畜牧兽医, 2000, 16(6): 37-39.

[2] 乔立东, 王金秋. 干扰素在兽医临床中的应用研究[J]. 中国牧业通讯, 2009(7): 9-11.

[3] 侯云德, 吴淑华. 干扰素[M]. 北京: 北京人民卫生出版社, 1981.

[4] Sekellick M J, Ferrandion A F, Hopkins D A,etal. Chicken interferon gene: Cloning, expression and analysis[J]. J Interferon Res, 1994, 14: 71.

[5] Digby M R,Lowenthal J W. Cloning and expression of the chicken interferon-γ gene[J]. J Interferon Res,1995,15:939-945.