无忧汤对CUMS抑郁症大鼠模型中枢递质5-HT和NE影响的研究

秦 竹唐瑶瑶王 臻

（1.云南中医学院，云南 昆明 650500；2.新沂市中医院，江苏 新沂 221400）

抑郁症是以显著而持久的抑郁情感或心境改变为主要特征，与应激密切相关的一类精神疾病[1]。抑郁症发病机制较为复杂，单胺递质假说认为其发生可能与脑内单胺类神经递质功能失衡有关，近年来此假说已得到证实和公认。5-羟色胺（5-HT）和去甲肾上腺素（NE）被认为是与抑郁症的发生关系最为密切的脑内单胺神经递质。无忧汤为清代陈士铎《辨证录》的有效名方，主治不寐，其临床表现与现代医学的早期抑郁症症状十份相似。目前尚未见关于无忧汤的相关实验研究报道，临床上在辨证论治的基础上使用无忧汤加味治疗抑郁症，能够有效地缓解和改善患者抑郁症状，疗效较好。本研究拟制作慢性不可预见性轻度应激（CUMS）抑郁症模型大鼠，予无忧汤不同剂量灌胃干预，检测治疗后模型大鼠脑组织中5-HT与NE含量，初步探讨无忧汤治疗抑郁症机制。

1 实验材料

1.1 实验药物 无忧汤由人参、白芍、当归、酸枣仁、竹茹组成，根据《方剂学》[2]古方药量换算表和《辨证录》换算法，综合为人参 15g、当归 15g、竹茹 9g、白芍 15g、酸枣仁 9g，以此量为实验中药组中剂量。药材购于云南中医学院门诊部，经鉴定均为正品。大剂量∶中剂量∶小剂量比为4∶2∶1，按照灌胃剂量煎药浓缩，分别为浓度4g生药/mL，2g生药/mL，1g生药/mL，存于4℃冰箱备用，用前恢复至常温。文拉法辛胶囊（成都康宏药业集团股份有限公司产品，批号：H19980051），25mg/粒，临用时用蒸馏水配成质量浓度为0.3mg/mL的药液。

1.2 实验动物 由川大实验动物中心提供的清洁级SD雄性大鼠60只，体重为180～200g。

1.3 实验试剂 5-羟色胺（5-HT）和去甲肾上腺素（NE）ELISA检测试剂盒，购于昆明晨绿生物科技开发有限公司。

1.4 实验仪器 自制敞箱，WLB-98-F型振荡器，LSY电热烤箱，游泳缸，电刺激仪，大鼠固定器，药物冷凝回流仪，酶标仪，恒温水浴箱，匀浆机，-20℃冰箱，-80℃冰箱，离心机。

2 实验方法

2.1 分组与给药 将60只大鼠随机分为空白对照组10只和抑郁造模组50只，空白对照组每笼5只饲养，正常饮食饮水，不予任何刺激。抑郁造模组大鼠适应性饲养1周后单笼饲养，并接受21d CUMS造模。造模成功后，将抑郁模型组50只大鼠随机均分为模型组、文拉法辛组和无忧汤高、中、低剂量组，分别连续灌胃相应药物或生理盐水21d，每日1次。

2.2 模型制备 采用孤养结合慢性不可预知性轻度应激刺激为造模方法，参照Willner等[3]方法：大鼠1只/笼饲养，构成孤养模型，在21d内接受各种不同的不可预知的应激性刺激，包括电击足底、冰水游泳、摇晃、热刺激、夹尾、禁水（24h）、禁食（48h）和昼夜颠倒等。每日随机安排一种刺激，平均每种刺激使用2次，使各种刺激成为长期不可预知的应激性刺激。

2.3 行为学测定 行为学指标是判定模型成功与否的一个重要标准，包括敞箱试验（Open-field test）和蔗糖水消耗试验等，能够较为全面地模拟人类抑郁症的行为，评价给药后对抑郁症心理行为的影响[4-6]。各组于实验0d（实验前）、21d（造模结束）、42d（给药结束）进行抑郁行为实验，一般经过2～3周的孤养和CUMS后，大鼠敞箱实验中的水平与垂直运动得分均明显下降，糖水消耗量明显减少，表现出与抑郁症患者类似的精神运动性迟滞、精力减退和对奖赏的反应性下降等症状。

2.4 脑组织样本制备 将大鼠断头，快速在冰盘上分离出脑组织，放入匀浆器中加生理盐水冰浴磨成匀浆液，4℃高速离心20min（离心速率为18000r/min），取上清液放-80℃超低温冰箱中保存待测。

2.5 中枢单胺类递质5-HT、NE的测定 采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验法（ELISA）定量测定大鼠脑组织匀浆液中5-HT、NE含量。往预先包被NE、5-HT抗体的包被微孔板中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的5-HT、NE呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

2.6 统计学方法 使用SPSS 17.0统计软件进行分析处理，组间比较采用单因素方差分析，统计结果用（）表示。

3 实验结果

实验结果显示：与空白对照组比较，模型组大鼠脑内5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）含量明显降低（P＜0.01），表明脑内5-HT、NE降低可能是造成抑郁的原因。与模型组比较，文拉法辛和无忧汤高、中剂量能显著提高抑郁模型大鼠脑内 5-HT、NE 含量（P＜0.05，P＜0.01），无忧汤低剂量能显著提高抑郁模型大鼠脑内NE含量（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠脑内单胺类神经递质5-HT、NE含量（） ng/mL

表1 各组大鼠脑内单胺类神经递质5-HT、NE含量（） ng/mL

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

组别 动物数空白对照组10模型组 10文拉法辛组 10无忧汤高剂量组 10无忧汤中剂量组 10无忧汤低剂量组 105-HT含量 NE含量8.43±1.57 15.18±3.44▲▲3.71±3.39** 8.21±0.89**6.72±1.98▲▲ 13.77±6.25▲▲7.79±1.68▲▲ 12.90±1.74▲▲7.18±1.62▲▲ 11.64±2.29▲4.62±2.02** 9.34±1.17▲*

4 讨论

自Schildkraut J.J.[7]1965年首次提出抑郁症发病的单胺递质学说以来，5-HT、NE被认为是与抑郁症的发生关系最为密切的脑内单胺神经递质。该假说认为，抑郁症的生物学基础是脑内单胺类神经递质的合成、释放减少或代谢增加而导致其突触间隙的数量减少或功能下降[8]。许多学者通过研究NE的代谢产物3-甲氧基4-羟基苯乙二醇（MHPG）和受体的变化来研究抑郁症患者脑内NE的改变，推测NE的缺乏可能是由于内源性的生成释放异常或由于NE系统慢性刺激所致的继发性耗竭[9-10]。药理学研究也表明，大多数的抗抑郁药都是通过直接或间接提高脑内单胺类神经递质在神经突触间隙的浓度或功能而发挥作用的。临床实验发现，抑郁症患者脑内5-HT、NE含量降低[11]，且随着药物的治疗和症状的改善，5-HT、NE含量逐步提高。

CUMS抑郁模型是目前比较公认的一种抑郁症动物模型，其慢性轻度不可预知性应激能升高脑内奖赏刺激的阈值和降低位置偏爱性，与抑郁症患者的核心症状快感缺乏非常相似。重要的是CUMS模型与人类抑郁症的发病机制也极为相似，其不可预知性的应激刺激模拟了人类抑郁症发病的机理，采用的刺激因子与现实生活中人们经常遇到的应激性事件的强度更为贴近[4-6]。该模型容易复制，持久而稳定，作为抑郁模型具有较高的价值，是作为抑郁症病理生理机制研究和抗抑郁药物筛选的最佳模型。

无忧汤为清代陈士铎《辨证录》治疗不寐症的有效名方，症见夜不能寐，恐鬼祟来侵，睡卧反侧，辗转不安，或少睡而即惊醒，或再睡而恍如捉拿，属于郁证心胆气虚型，具有补气养血、养心安神、清心除烦之功用。本实验证明：无忧汤能够提高孤养加CUMS抑郁模型大鼠脑内单胺神经递质5-HT和NE的含量，提示无忧汤通过提高大鼠脑内单胺神经递质5-HT和NE的含量或活性，从而达到治疗抑郁症的目的，以高剂量组效果最好，这也为临床应用无忧汤治疗抑郁症提供基本剂量依据。

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