协同发酵法与酶解法制备牛肉呈味料的对比研究

闫 爽，高献礼，陆 健，*

（1.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡214122；2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡2141222；3.江南大学生物工程学院，江苏无锡 214122）

随着人们生活水平的提高和生活节奏的加快，传统的饮食方式已经发生了很大的改变。据统计数据[1]显示，2011年1～9月份，我国方便食品销售额超过1800亿元人民币，同比增长48.13%，方便食品已经成为我国居民饮食的重要组成部分。但我国方便食品的发展仍然具有较大的潜力，而咸味香精是方便食品行业发展的灵魂，因此咸味香精行业的发展具有光明的前景。我国咸味香精生产始于20世纪80年代，经过近30年的发展已经形成独立的产业，年销售额超过100亿元人民币，与咸味香精相关的食品工业和餐饮业的销售额在10000亿元以上[2-3]。其中牛肉风味的咸味香精是咸味香精家族中销售量最大的品种，而牛肉呈味料是牛肉风味咸味香精的主要载体和呈味成分，是生产牛肉风味咸味香精的关键。目前，牛肉呈味料主要经原料（牛肉）蒸煮、绞肉、外加酶制剂酶解（蛋白酶）、美拉德反应、添加辅料（麦芽糊精等）、干燥（喷雾干燥或微波干燥等）、风味后修饰（添加液体牛肉香精等）等工艺制备而成[4-6]。此工艺具有生产工艺易控制、省时等优点；但也存在生产成本高、产品香气不足（需经后续添加液体牛肉香精，进一步增加生产成本）等缺点。本实验室在对现有酶解工艺和所用原料及酶制剂分析的基础上，结合现代发酵工艺和微生物代谢控制原理，提出以双菌种协同发酵法生产牛肉呈味料的新工艺。米曲霉具有生长快、酶系丰富、不产毒素等优点，能分泌多种水解酶系，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶等，但由于米曲霉所分泌的具有外切酶活性的酸性蛋白酶较少，而黑曲霉分泌的胞外蛋白酶以酸性蛋白酶为主[7-8]。此工艺以实验室筛选保藏的米曲霉和黑曲霉为发酵菌种，以牛肉为主要原料，利用米曲霉（以碱性、中性蛋白酶为主）和黑曲霉（以酸性蛋白酶）所产酶系互补的特点对原料进行适度降解，并采用美拉德反应等工艺制备牛肉呈味料，具有安全性高（大量减少液体牛肉香精的使用量）、产品天然、成本低等特点。因此，具有潜在的商业应用价值。本文以目前生产实践中普遍使用的酶解工艺制备的牛肉呈味料为对照，对比研究了协同发酵法所生产牛肉呈味料的主要理化指标和感官评价。为我国咸味香精行业新产品的开发提供方法参考，为此工艺的推广应用提供数据积累。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

米曲霉、黑曲霉 本实验室筛选保存；复合蛋白酶、风味蛋白酶 诺维信公司；木瓜蛋白酶 庞博生物工程有限公司；牛肉、麸皮、豆粕、面粉 购自无锡当地市场；其他试剂 均为分析纯；定性滤纸 杭州沃华滤纸有限公司。

G154DWS型自动高压蒸汽灭菌器 致微（厦门）仪器有限公司；Blue pard恒温恒湿培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；WFZ UV-2100型紫外-可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；KjeItec2300型自动凯氏定氮仪 瑞典FOSS分析仪器有限公司；FE20 pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；H1850R型台式高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；垂直电泳仪 美国bio-rad公司；Agilent 1100型氨基酸专用高效液相色谱仪 美国安捷伦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白酶活力的测定 成曲和商品蛋白酶的活力测定参照中华人民共和国商业标准蛋白酶活力测定法[10]，测定波长为680nm。酪氨酸标准曲线为：y=99.494x-0.9005，R2=0.9994，吸光常数K=99.06。

表1 发酵及酶解法制备牛肉呈味料的工艺条件Table 1 Technical conditions of preparing beef flavor potentiators by fermentation and enzymatic hydrolysis

1.2.2 发酵及酶解法制备牛肉呈味料的工艺条件本研究以三种酶解法制备的牛肉呈味料为对照，对比研究协同发酵法制备的牛肉呈味料各理化指标和感官评价结果。酶解条件参照目前工业生产中所普遍使用的工艺，具体使用的酶制剂种类、酶活、添加量、酶解温度和时间见表1，其中：SF指协同发酵法；PTF指复合蛋白酶和风味蛋白酶分步酶解（复合蛋白酶∶风味蛋白酶=2∶1）；PPF指木瓜蛋白酶和风味蛋白酶分步酶解（木瓜蛋白酶酶解∶风味蛋白酶=2∶1）；PT指复合蛋白酶酶解；PTF和PPF中，风味蛋白酶为酶解开始2h后再添加。

1.2.3 协同发酵法制备牛肉呈味料 牛肉绞碎后，与麸皮和豆粕（各占牛肉量的15%和5%）混合拌匀，121℃灭菌20min。待灭过菌的原料冷却后，将其捣碎。接种过程如下：先将米曲霉和黑曲霉种曲（接种比例为3∶1，接种量为0.6%，种曲制备方法见参考文献[9]）与面粉（占牛肉量的30%）充分混匀，再将面粉与灭菌后的原料混合拌匀，于30℃条件下进行培养。培养过程中注意翻曲，防止物料层温度过高（＜35℃）。成曲制备结束后，测定其蛋白酶活力，然后将成曲粉碎，按照1∶3的料水比加入水并用搅拌器搅拌均匀后，于45℃条件下进行液态发酵，发酵结束后置于90℃水浴中加热15min，冷却后5000r/min离心20min，样品在4℃下保存备用。

1.2.4 酶解法制备牛肉呈味料 牛肉与辅料混合并灭菌，冷却后捣碎，添加一定量的水，使其所含原辅料比例及含水量与1.2.3样品一致，加入蛋白酶在50℃条件下进行酶解反应，所用蛋白酶种类和添加量见表1。酶解结束后置于90℃水浴中加热15min，冷却后5000r/min离心20min，样品在4℃下保存备用。

1.2.5 发酵和酶解产物的总氮、氨基酸态氮含量的测定 取1.2.3和1.2.4中的上清液，测其总氮和氨基酸态氮的含量。总氮的测定采用凯氏定氮法；氨基酸态氮含量的测定采用甲醛滴定法。

1.2.6 发酵和酶解产物水解度和蛋白质回收率的测定 水解度（DH）、蛋白质回收率（PR）的测定方法分别参考文献[11-12]。

1.2.7 发酵和酶解产物中肽基氮含量的测定[13]准确吸取1.2.3和1.2.4中的上清液1mL，用15%的三氯乙酸溶液定容至25mL，混匀并静置5min，用双层定性滤纸过滤，去除初滤液，取滤液10mL用凯氏定氮法测总氮（酸溶性氮），肽基氮含量=酸溶性氮-氨基酸态氮。

1.2.8 发酵和酶解产物的SDS-PAGE分析 将1.2.3和1.2.4中的上清液经10000r/min，4℃离心10min，取上清，用于电泳实验。具体电泳方法参考文献[14]，样品在浓缩胶中的电压为60V，进入分离胶后，将电压调至80V，当染料前沿距凝胶下缘1cm左右时，停止电泳。将凝胶从玻璃板中剥离出，浸泡于固定液中固定30min，然后换染色液染色2h后，用蒸馏水冲洗数次，再用脱色液脱色至条带清晰。

1.2.9 发酵和酶解产物中游离氨基酸的测定 将1.3.2和1.3.3中的上清液用三氯乙酸（浓度5%）静置沉淀1h后用双层定性滤纸过滤，滤液经10000r/min离心10min，取上清液，利用高效液相色谱法测定游离氨基酸的含量。采用HYPERSIL OSD色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），柱温40℃，紫外检测器波长338nm，洗脱流速1.0mL/min。

1.2.10 感官品评 由8人组成感官评定小组（20～30岁，5男，3女），对样品间香气和滋味的差别进行定量描述分析。其中香气的评价指标包括：酱香、肉香、腥味、酸味、胺味，滋味的评价指标包括：鲜、甜、酸、咸、苦、醇厚，评分值从0分（无察觉）到9分（最强）。

2 结果与讨论

2.1 发酵及酶解产物水解度和蛋白质回收率的对比分析

图1 发酵及酶解产物的水解度和蛋白质回收率Fig.1 Degree of hydrolysis and protein recovery of fermentation and enzymolytic products

发酵及酶解产物水解度和蛋白质回收率的测定结果如图1所示。水解度是表示蛋白质中肽键裂解程度的指标。从图1中可知，SF和PTF、PPF、PT所得水解度分别为51.39%、22.67%、25.58%、12.29%，蛋白质回收率为70.99%、48.80%、43.54%、48.95%；SF法比最优酶解法的水解度和蛋白质回收率分别高126.69%和45.47%。Su等[15]利用提取自米曲霉的粗蛋白酶粉与商品蛋白酶分别水解豆粕蛋白，水解产物的水解度分别为43.4%和低于20%，蛋白质回收率分别为80.6%和59.4%，与本研究结果相符。以上结果表明，采用协同发酵法的水解度和蛋白质回收率高于酶解法，协同发酵法有利于得到更多的蛋白质降解产物，提高原料利用率。这可能是因为米曲霉和黑曲霉在制曲过程中，除了可以分泌大量的蛋白酶之外，还可以分泌纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、果胶酶等，降解原料中的纤维素和半纤维、淀粉等成分，从而降低底物的粘度，更有利于蛋白酶直接作用于原料中的蛋白质[16]。

2.2 发酵法和酶解法制备牛肉呈味料过程中氮存在形式的变化

图2 发酵及酶解产物中总氮、氨基酸肽氮和肽基氮的变化Fig.2 Contents of total nitrogen,amino nitrogen and peptide-nitrogen of fermentation and enzymolytic products

发酵及酶解产物中可溶性总氮、氨基酸态氮、肽基氮的含量如图2所示。从图2中可以看出，SF法的总氮含量略高于其他方法；SF法和三种酶解法产物的氨基酸态氮含量分别达到0.68、0.27、0.31、0.16g/100mL，SF产物的氨基酸态氮含量高于酶解产物，这说明霉菌所分泌蛋白酶的作用位点较为广泛，促使产物中氨基酸态氮含量更高，从而使SF法具有较高的水解度。从图2中还可以看出，SF产物中肽基氮的含量低于酶解法，这是由于发酵法的水解度较高，使得小肽被水解成了氨基酸，同时，发酵法在制曲过程中，原料中本身存在的肽及蛋白质也会在一定程度上被降解成氨基酸。

2.3 发酵及酶解产物的SDS-PAGE分析

图3 发酵及酶解前后样品的SDS-PAGE图谱Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of the samples

图3为发酵及酶解前后样品的SDS-PAGE图谱。从图3中可以看出，发酵法和酶解法均可以将原料中的大分子蛋白质分解为小分子蛋白。对电泳图谱进行积分光密度扫描，得出发酵后样品中分子量小于25ku的条带的相对百分含量为88.9%，而酶解产物中分子量小于20ku的条带的相对百分含量最高为72.54%。结合肽基氮的测定结果，虽然发酵产物中肽基氮的含量低于酶解产物，但其中小分子量肽的比例高于酶解产物。

2.4 发酵及酶解产物的游离氨基酸组成分析

SF产物和三种酶解产物的游离氨基酸组成见表2。SF产物的总游离氨基酸含量为1221.48mg/100mL，显著高于酶解产物，该结果与氨基酸态氮的测定结果相一致。SF产物中天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸在游离氨基酸中所占比例明显高于三种酶解产物，丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸在游离氨基酸中所占比例明显低于酶解法，其原因可能是不同蛋白酶对底物选择性及其酶切位点具有一定的差异。

分析不同滋味的氨基酸在游离氨基酸中所占的比例，可以发现，在SF产物中鲜味氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）的比例为22.46%、甜味氨基酸的比例为37.13%，明显高于酶解产物，同时SF产物中苦味氨基酸的比例则低于酶解产物。由于在制曲过程中米曲霉会分泌谷氨酰胺酶，因此，SF产物中鲜味氨基酸比例较高。与文献[19]中利用米曲霉和酵母菌发酵制备的牛肉香精前体物相比，本研究中发酵法制备的牛肉呈味料中鲜味氨基酸在总游离氨基酸中的比例高于前者，但绝对含量则低于前者，其原因是由于料水比的不同，使得产物中氨基酸的浓度有所差异。

表2 发酵及酶解产物的游离氨基酸组成Table 2 Free amino acid composition of products by fermentation and enzymatic hydrolysis

2.5 感官品评

图4 发酵法及酶解法产物的感官品评结果Fig.4 The sensory evaluation of products by fermentation and enzymatic hydrolysis

SF法和三种酶解法制备牛肉呈味料的感官品评结果如图4所示。对气味的感官品评结果进行方差分析，SF产物的酱香和肉香显著优于酶解产物（p＜0.05），其平均得分分别比酶解法提高了73%和67%，这可能是由于发酵法在制曲过程中由霉菌形成丰富的酶系为风味物质的形成奠定了基础。另外，SF产物的腥味平均得分比酶解产物降低了35%。

滋味的感官品评结果表明，发酵产物的鲜味显著高于酶解法（p＜0.05），其平均得分比酶解法提高了46%，可能是因为，发酵产物中鲜味氨基酸的含量和比例高于酶解产物。PPF酶解产物的苦味显著高于其他样品（p＜0.05），其次分别是SF、PT、PPF产物。吴建中[20]研究了蛋白水解物的苦味与水解度之间的关系，由于蛋白质的水解，原来包裹在分子内部的疏水性氨酸残基暴露出来，使其产生苦味，因此蛋白水解物的苦味随着水解度的增加而增强，而本研究中SF产物的水解度远大于PPF，但其苦味却低于后者，这是因为在制曲过程中，黑曲霉分泌的酸性蛋白酶为外切蛋白酶的活性，外切蛋白酶可以选择性的释放出肽链末端的氨基酸残基以减轻水解产物的苦味[20-21]。

3 结论

以牛肉为主要原料，利用米曲霉和黑曲霉协同发酵制备牛肉呈味料，同时分别采用复合蛋白酶+风味蛋白酶分步酶解、木瓜蛋白酶+风味蛋白酶分步酶解、复合蛋白酶单酶酶解三种工艺对牛肉进行酶法水解制备牛肉呈味料。将发酵法与酶解法制备的样品进行比较，可以得出以下结论：与目前工业生产中所普遍使用的酶解工艺相比，发酵法的水解度和蛋白质回收率分别比最优酶解法高出126.69%和45.47%；总氮和氨基酸态的含量也高于酶解法；对制备的样品进行氨基酸组成分析，发酵产物中鲜味氨基酸含量高于酶解产物；而感官品评的结果也表明，发酵产物具有更好的酱香、肉香和鲜味，其感官品评的平均得分分别比酶解法提高了73%、67%和46%。

同时，由于发酵法省去了大量商品酶的使用，可以降低部分生产成本：以1000kg原料生产牛肉呈味料，酶解法所使用商品蛋白酶及液体香精的成本为3500～4000元，而发酵法所需种曲的成本仅为几十元。综上，协同发酵法制备牛肉呈味料在产品品质、生产成本上比酶解法更具优势。

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