肝X受体α及Endoglin基因在妊娠期高血压疾病患者胎盘中的表达及意义

王晶，东星，杨彩霞，王心，尚丽新

妊娠期高血压疾病是妊娠期特有的疾病，是导致孕产妇和围生儿死亡的主要原因之一[1]，目前其发病机制尚未完全阐明。肝X受体(LXRs)作为一种氧化型固醇激活的核受体，参与机体多种生理活动的调节，包括胆固醇代谢﹑脂肪代谢﹑糖代谢和炎症过程等[2-4]。Endoglin与滋养细胞的浸润功能密切相关。本研究采用Real-time PCR检测妊娠期高血压疾病患者胎盘组织中LXRα与Endoglin mRNA的相对表达量，从基因水平探讨二者与妊娠期高血压疾病发病的关系，以期为该病的防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2010年8月－2011年4月在北京军区总医院产科住院分娩的妊娠期高血压疾病患者44例作为妊娠高血压疾病组，年龄29.5±3.2岁，孕龄262.1±13.9d。其中妊娠期高血压患者15例，轻度子痫前期患者14例，重度子痫前期患者15例。妊娠期高血压疾病的诊断标准参照乐杰主编的《妇产科学(第7版)》[1]。选取同期正常晚期妊娠妇女16例作为对照组，年龄28.6±3.9岁，孕龄264.3±14.6d。两组孕妇均为单胎，孕前无原发性高血压﹑糖尿病﹑慢性肾炎﹑甲状腺功能亢进症﹑肝炎及结核等急慢性病史，无烟酒等不良嗜好。两组孕妇均自愿参加本试验并签署知情同意书。两组孕妇年龄﹑孕龄﹑孕次及分娩方式之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 胎盘娩出后，立即剪取脐带对侧胎盘组织约300mg，剪成约1cm×1cm×1cm大小，装入冻存管中，投入液氮过夜后转入－80℃低温冰箱保存，以备RNA提取。

1.2.2 胎盘组织LXRα及Endoglin mRNA表达检测

1.2.2.1 RNA提取与反转录 按照大连宝生物工程有限公司Trizol总RNA提取试剂说明提取RNA。用紫外分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检测所获RNA的完整性﹑纯度和含量。RNA置－80℃保存备用。按以下条件进行反转录：30℃ 5min，42℃ 60min，99℃ 5min，5℃ 5min。反应体系为20μl。

1.2.2.2 Real-time PCR LXRα上游引物5'-TGGAGACATCTCGGAGGTAC-3'，下游引物5'-GCAATGAG CAAGGCAAACT-3'；Endoglin上游引物5'-TAGCCCT GCGTCCCAAGA-3'，下游引物5'-CGATGAGGAAGG CACCAAA-3'。采用SYBR Green荧光染料法进行Real-time PCR扩增。反应体系为20μl，包括1×Real Master Mix，1×SYBR Green，上﹑下游引物各1μl(5pmol)及1μl模板。以GAPDH作为内参照。反应条件为：94℃预变性5min；94℃ 30s﹑52℃ 30s﹑72℃ 40s，30个循环；72℃延伸10min。扩增后获得各组Ct值，绘制标准曲线。用基于ΔΔCt的方法进行相对定量分析，基因表达差异为–2ΔΔCt。ΔΔCt=ΔCt样品－ΔCt内参考。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胎盘组织中LXRα及Endoglin的熔解曲线 胎盘组织中LXRα及Endoglin熔解曲线见图1，横坐标为温度，纵坐标为荧光强度，结果显示二者均有单一的产物峰。

图1 LXRα及Endoglin的熔解曲线Fig.1 Melting curve of LXRα (A) and Endoglin (B)

2.2 Real-time PCR产物电泳结果 经2%琼脂糖凝胶电泳检测，LXRα及Endoglin在正常孕妇﹑妊娠期高血压疾病患者和阳性对照组均出现与预期大小一致的片段，阴性对照没有出现任何条带(图2)。

2.3 胎盘组织中LXRα及Endoglin mRNA的表达单因素方差分析显示，妊娠期高血压疾病组孕妇胎盘组织中LXRα及Endoglin mRNA相对表达量与对照组比较明显增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。进一步两两比较显示，重度子痫前期组﹑轻度子痫前期组LXRα及Endoglin mRNA相对表达量明显高于对照组，且重度子痫前期组明显高于轻度子痫前期组，差异有统计学意义(P＜0.05)，而妊娠期高血压组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05，图3)。

图2 各组胎盘组织中LXRα及Endoglin的PCR产物电泳结果Fig.2 PCR products of LXRα and Endoglin in placenta from four groups (Gel electrophoresis)

图3 各组胎盘组织中LXRα及Endoglin mRNA的相对表达量Fig.3 Relative expression of LXRα and Endoglin mRNA in placenta tissue of four groups

3 讨 论

3.1 LXRα与妊娠期高血压疾病 LXRs是孤儿核受体家族成员，研究证实其与胎盘组织中脂肪酸的转运和代谢有密切关系，并可抑制胎盘滋养细胞分泌HCG，在人类胎盘中发挥重要作用[5]。

Plosch等[6]研究发现LXRα及其目标基因ATP结合盒转运子A1(ABCA1)在人类胎盘组织中呈高表达，其表达水平受低氧的调节，该调节机制失衡是导致子痫前期患者胎盘缺血的原因之一。本研究结果显示，妊娠期高血压疾病组胎盘组织LXRα mRNA表达明显高于对照组，其中轻度子痫前期组明显高于对照组，重度子痫前期组明显高于轻度子痫前期组，推测LXRα表达水平升高与子痫前期的发病及病情进展有关。LXRα能增加血浆甘油三酯(TG)生成[7]，是动脉粥样硬化发生的独立危险因素。子痫前期患者胎盘组织中LXRα高表达可能会导致子宫螺旋动脉发生粥样硬化，使胎盘血流灌注减少，从而引发子痫前期的一系列症状。LXRα的激活剂可提高巨噬细胞肿瘤坏死因子(TNF)mRNA的表达水平，TNF诱导血管内皮细胞产生前列腺素和内皮素，导致血管收缩和血压升高[8]。LXR特异性配体GW3965能够剂量依赖性地抑制血管内皮细胞EA.hy926中内皮素1(ET-1)的mRNA和蛋白表达，并且抑制ET-1启动子的转录活性，从而起到降压的作用[9]。

3.2 Endoglin与妊娠期高血压疾病 Endoglin基因位于人染色体9q34，是一种同型二聚体(TGF-β1和TGF-β3的复合受体)跨膜糖蛋白，主要表达于人类内皮细胞表面和足月胎盘合体滋养层细胞表面。研究发现，在胎盘及胎盘血管快速发育期，Endoglin表达增强，但持续维持在低水平，这有利于正常胎盘的形成和胚胎的发育。

本研究发现，妊娠期高血压疾病组胎盘组织中Endoglin mRNA表达量明显高于对照组，且轻﹑重度子痫前期组均明显高于对照组，提示胎盘组织中Endoglin水平与妊娠期高血压疾病的发病及病情发展有关，与Gu等[10]的研究结果一致。有研究证实，缺氧可以诱导孕鼠胎盘及循环中Endoglin表达增加，且增高的Endoglin与孕鼠高血压密切相关[11]，而胎盘组织中Endoglin表达上调可抑制TGF-β调控的促细胞凋亡作用，影响胎盘血管发育和重塑[12]，从而影响滋养细胞的浸润功能，引起胎盘浅着床，参与妊娠期高血压疾病的发病。Endoglin与TGF-β1结合，通过不同途径使一氧化氮(NO)生成减少，导致血管收缩，外周血管阻力增加，血压升高[13]。此外，Endoglin可抑制滋养细胞中基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9的表达，从而使滋养细胞降解细胞外基质的能力减低，侵袭能力下降，引起妊娠高血压疾病的一系列症状[14]。

3.3 LXRα及Endoglin的相关性研究 Henry-Berger等[15]研究发现，LXRα可上调胎盘组织中Endoglin的表达，继而阻断TGF-β/Endoglin信号途径，导致血管内皮细胞屏障受损，引起细胞水肿及蛋白尿。

总之，本研究结果显示胎盘组织中LXRα及Endoglin mRNA表达水平增高与妊娠期高血压疾病的发生及发展密切相关，但其参与子痫前期病理生理过程的具体机制还需进一步探讨。检测并调控胎盘组织中LXRα及Endoglin的表达水平对于防治妊娠期高血压疾病可能具有一定的临床意义。

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