MRL/lpr小鼠胸腺异位基因的表达

魏旋子 刘声茂 田 庚 于宏宇 卢雪红 罗 萍 (吉林大学第二医院肾病内科，吉林 长春 3004)

生理状况下胸腺基质细胞(皮质及髓质上皮细胞、树突细胞等)可表达多种组织特异性基因，称为异位基因表达。胸腺髓质上皮细胞(mTECs)是异位基因表达的最重要细胞，成熟mTECs几乎表达所有异位基因〔1〕。而异位基因表达诱导耐受是通过自身反应性T细胞的克隆无能和克隆清除实现的〔2，3〕。系统性红斑狼疮(SLE)是一种常见的器官非特异性自身免疫病，临床表现为多系统、多器官损害。检测MRL/lpr狼疮小鼠〔4〕胸腺异位基因表达的情况为探讨其与中枢耐受的关系提供依据。

1 材料与方法

1.1 尿蛋白及抗核抗体的检测 对照组BAB/C小鼠 (19～21 g)购自吉林大学实验动物中心;模型组MRL/lpr狼疮小鼠(30～37 g)购自北京斯莱克动物中心。每组5只，均为雌性，鼠龄10周龄。用尿蛋白试纸条蘸取小鼠尿液，与标准尿液分析试纸条的颜色进行比较，结果以“－～”表示。抗核抗体检测采用间接免疫荧光法，按试剂盒(德国欧蒙公司)说明操作，荧光二抗为FITC标记山羊抗小鼠IgG，于荧光显微镜下观察结果。

1.2 胸腺上皮的分离 无菌取胸腺，剪碎后用DMEM冲洗去除游离胸腺细胞，Trizol冻存胸腺上皮备RNA提取〔5〕。

1.3 异位基因表达的检测 提取Trizol冻存的胸腺上皮总RNA。cDNA逆转录采用Takara的AMV RTase，按说明书进行操作。通过预实验确定PCR反应条件和最适循环数，以保证PCR产物量与起始cDNA量呈线性相关。组织特异性基因唾液蛋白2(SP2)、甲状腺球蛋白(TG)，及组织非特异性基因组织蛋白酶L(CTSL)和C反应蛋白(CRP)。以β-actin作为内参照，RT反应条件为30℃ 10 min、45℃ 30 min、5℃ 5 min。PCR引物序列引自文献〔6〕，由上海生工合成，引物序列见表1，PCR反应体系为 25 μl，包括 Ex Taq 0.125 μl、10 × ExTaq 缓冲液2.5 μl、dNTP 2 μl(2.5 mmol/L)、Distilled Water 14.5 μl、正、反义引物各 0.5 μl(20 μmol/L)、cDNA 5 μl。RT-PCR 产物的检测:取5 μl PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，含0.5 μg/ml溴乙啶。凝胶扫描成像系统记录电泳结果。用Imagemaster VDS(Pharmacia Biotech)图像分析软件分析光密度值，以异位基因/β-actin光密度比值表示异位基因表达水平，以100 bp DNA ladder V(鼎国)相对分子质量为标准。

表1 PCR引物名称、序列和产物大小

1.4 异位基因相关器官的病理 分离小鼠唾液腺，用100 ml/L甲醛固定后，依次进行系列梯度脱水、浸蜡、包埋及切片(厚度2 μm)后，按常规进行HE染色，于光镜下观察结果。

2 结果

2.1 小鼠尿蛋白检测结果 对照组尿蛋白均呈阴性，模型组中1只+、4只。

2.2 抗核抗体检测结果 对照组均为阴性，模型组抗核抗体滴度为1∶320 ～1∶1 000。见图1。

2.3 异位基因表达水平 MRL/lpr组胸腺中CTSL、SP2、TG和CRP四种异位基因的表达均明显减弱(图2)，Balb/C和MRL/lpr组 CTSL、SP2，TG、CRP四种异位基因表达分别为〔(148.44±16.5)vs(93.44 ±11.9)〕，〔(30.67 ±3.5)vs(5.63 ± 2.2)〕，〔(72.41 ± 10.8)vs(21.06 ± 3.6)〕，〔(90.82±11.9)vs(40.23±6.4)〕。

2.4 唾液腺病理 MRL/lpr狼疮小鼠唾液腺有大量的炎细胞浸润，而BAB/C小鼠未见炎细胞浸润。见图3。

图1 抗核抗体检测结果(免疫荧光，×200)

图2 胸腺异位基因相关蛋白的表达(Western印迹)

图3 各组小鼠唾液腺病理改变(Masson，×400)

3 讨论

中枢耐受是指在中枢免疫器官中，识别自身抗原的T、B细胞克隆被清除进而形成自身耐受。中枢免疫器官是免疫细胞发生、分化、成熟的场所，包括骨髓及胸腺。其中T祖细胞经血液循环到达胸腺，在胸腺中经过阳性和阴性的选择后分化为成熟T细胞进入外周循环。如果在胸腺中出现选择异常，则有可能出现中枢耐受缺陷。而目前认为，异位基因表达可通过自身反应性T细胞的克隆清除、克隆无能或形成调节性T细胞诱导中枢免疫耐受〔1〕。

SLE是一种常见的非特异性自身免疫病，血清中存在以抗核抗体为主的大量抗体，但病因和发病机制尚未完全阐明。其中MRL/lpr小鼠是常用的SLE动物模型之一，其症状与人类SLE相似，包括显著的血清自身抗体、免疫复合物肾小球肾炎、血管炎等。含有与细胞自发性程序性死亡有关的Fas基因隐性突变，出现淋巴细胞增生，导致T细胞增生，全身淋巴器官肿大。本文中四种与发病有关的SP2、TG、CTSL和CRP异位基因表达量明显降低，这会导致自身反应性T细胞逃避阴性选择而到外周进而出现中枢耐受，针对SP2的自身反应性T细胞会导致唾液腺的损伤而出现唾液腺炎的改变。模型组其他异位基因表达降低与器官损害的相关性还需进一步研究。

尽管多种机制〔7〕参与SLE的发病，然而实验结果表明胸腺基质细胞的组织特异性抗原如SP2、TG、CTSL和CRP表达水平的降低参与MRL/lpr的发生及发展，这不仅完善了SLE的发病机制，如何调控异位基因的表达也将成为治疗的契机。

1 Derbinski J，Gabler J，Brors B，et al.Promiscuous gene expression in thymic epithelial cells is regulated at multiple levels〔J〕.J Exp Med，2005;202(1):33-45.

2 Husbands SD，Schonrich G，Arnold B，et al.Expression of major histocompatibility complex class I antigens at low levels in the thymus induces T cell tolerance via a non-deletional mechanism〔J〕.Eur J Immunol，1992;22(10):2655-61.

3 Klein L，Klein T，Ruther U，et al.CD4 T cell tolerance to human C-reactive protein，an inducible serum protein，is mediated by medullary thymic epithelium〔J〕.J Exp Med，1998;188(1):5-16.

4 张 飚，唐福林.系统性红斑狼疮模型鼠MRL/lpr研究进展〔J〕.中华风湿病学杂志，2006;2(10):110-3.

5 陈继冰，于春雷，刘 阳，等.STZ诱导小鼠糖尿病模型中胸腺异位基因表达的研究〔J〕.免疫学杂志，2006;22(1):37-9.

6 Derbinski J，Schulte A，Kyewski B，et al.Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self〔J〕.Nat Immunol，2001;2(11):1032-9.

7 He CY，Lu XH，Luo P，et al.Therapeutic effect of leflunomide on the development of experimental lupus nephritis in mice〔J〕.Rheumatol Intern，2012;3(32):633-8.