丹酚酸B对老年性痴呆模型的保护作用

程继明 周翔鱼 白向东 (银川市第一人民医院神经内科，宁夏 银川 750001)

老年性痴呆(AD)是老年人中常见的神经退行性疾病，80岁以上老年人高发，病人出现认知障碍和学习记忆能力的损伤。AD发病机制尚不明确，目前有氧自由基学说、β样淀粉蛋白沉积学说、Tau蛋白过度磷酸化学说等。AD主要病理改变为老年斑、神经纤维缠结和突触丢失。自由基造成的氧化损伤也参与了AD发病过程〔1〕。老年人自由基清除能力下降，导致出现大量自由基，从而损伤细胞功能，加速AD发病。过氧化氢酶(CAT)和谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-PX)两者协同对抗体内自由基，保护细胞功能和结构完整功能。丹酚酸B(Sal B)是中药丹参的主要成分，以往研究表明Sal B具有抗氧化、抗β淀粉样蛋白导致的细胞毒性〔2〕。Sal B还能促进血管再生，促进神经发生。以往报道显示Sal B可以保护血管性痴呆动物模型大鼠的学习记忆能力和血管功能。但是Sal B在AD模型中的作用尚不明确。本实验旨在观察Sal B在东莨菪碱模型的作用。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 雄性SD大鼠购买自华中科技大学协和医院动物实验中心。大鼠随机分成空白组、模型组和治疗组。模型组大鼠腹腔注射东莨菪碱2 mg/kg，治疗组腹腔注射东莨菪碱2 mg/kg，36 mg/kg Sal B溶于1 ml蒸馏水中灌胃。空白组给予相应的生理盐水处理，每天处理一次，连续处理7 d。

1.2 试剂 东莨菪碱购买自天津市福顺化学试剂厂。CAT试剂盒、GSH-PX测试盒购买自南京建成生物工程研究所。Western印迹所用抗体购买自Abcam公司。

1.3 Morris水迷宫 SD大鼠造模1 w后进行水迷宫实验，水迷宫由一个内壁及底部为黑色的圆柱形水池构成，直径150 cm，高50 cm，分为4个象限，第Ⅲ象限中央放一个30 cm的透明有机玻璃平台，迷宫及平台位置整个实验过程中均保持不变。水温控制在23℃。大鼠从水池边上每个象限中点放入水池，软件记录大鼠在60 s内找到第Ⅲ象限内平台的时间，即潜伏期。让大鼠在平台上放置20 s，连续训练6 d，第7天撤除平台检测大鼠的潜伏期和穿越平台的次数。

1.4 免疫印迹 10%SDS-PAGE胶电泳，湿式转移法将胶里面的蛋白转至NC膜上，含3%牛血清白蛋白的TBS溶液封闭30 min，一抗4℃封闭过夜，T-TBS漂洗后，HRP结合的二抗以1∶1 000孵育1 h，DAB 显色，照相留底。

1.5 CAT活力测定 称取海马组织重量，置于9倍生理盐水中，电动匀浆器研磨成10%组织匀浆，2 500 r/min离心10 min，取上清10 μl，加入9倍的生理盐水，变为1%的海马匀浆液100 μl，按试剂盒说明书进行操作。最后405 nm处测OD值。

1.6 GSH-PX活力测定 称取海马组织重量，置于9倍生理盐水中，电动匀浆器研磨成10%组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清 10 μl，加入 390 μl生理盐水，变成 0.25% 的海马匀浆液400 μl，按照试剂盒说明书进行操作。最后412 nm处测OD值。

2 结果

2.1 Sal B显著改善AD大鼠的学习记忆能力 随着时间推移，各组大鼠寻找平台的潜伏期逐渐缩短，学习能增强记忆能力。但是模型组和空白组相比，其潜伏期明显延长(P＜0.01);治疗组和模型组相比，治疗组的潜伏期显著缩短(P＜0.01)。见表1、表2。

2.2 各组大鼠CAT、GSH-PX比较 由表3能够看出模型组大鼠海马中CAT活性显著下降(P＜0.05)。经Sal B治疗后，模型组大鼠海马的CAT活性明显提高(P＜0.05)。模型组大鼠海马中GSH-PX活性显著下降(P＜0.05)。经Sal B治疗后，模型组大鼠海马的GSH-PX活性明显提高(P＜0.05)。

2.3 各组凋亡相关蛋白 模型组bcl-2明显下降(P＜0.01)，caspase-3激活(P＜0.01);给予Sal B处理后，bcl-2表达量上升，caspase-3激活被抑制(P＜0.01)。见图1。

表1 各组大鼠学习期间每日平均潜伏期(±s ，s，n=12)

表1 各组大鼠学习期间每日平均潜伏期(±s ，s，n=12)

1)与空白组比较，2)与模型组比较:P＜0.01;下表同

组别 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天空白组 60.0±0 40.2±3.4 28.2±3.5 16.0±4.2 9.1±2.8 8.7±3.1模型组 60.0±0 54.6±5.61) 48.3±4.31) 37.5±4.21) 32.3±4.31) 26.2±4.31)治疗组 60.0±0 45.0±3.22) 33.3±4.02) 20.0±4.32) 12.4±4.22) 12.2±3.22)

表2 各组大鼠空间记忆实验结果(±s ，n=12)

表2 各组大鼠空间记忆实验结果(±s ，n=12)

组别 第Ⅲ象限停留时间(s) 穿越平台次数(次)空白组45.3±2.2 6.2±1.21模型组 21.1±4.31) 3.3±2.11)治疗组 40.1±3.12) 5.3±2.22)

表3 各组大鼠海马组织CAT活力比较(±s，n=10)

表3 各组大鼠海马组织CAT活力比较(±s，n=10)

组别 CAT(U/mgprot) GSH-PX(U/mgprot)空白组18.3±1.2 162.2±14.5模型组 12.1±1.41) 136.4±13.41)治疗组 17.5±1.32) 155.6±13.32)

图1 凋亡相关分子的表达变化

3 讨论

AD的主要病理变化是β淀粉样蛋白沉积、tau蛋白过度磷酸化和突触丢失，它的发病机制有多种学说，但都无法做出全面解释。东莨菪碱是一种M受体的拮抗剂，腹腔注射可导致大鼠的空间学习记忆能力出现障碍，被广泛应用来模仿AD病人的记忆损伤〔3〕。

Sal B是从丹参中分离出来的主要水溶性酚酸类的化合物，是丹参中重要的活性部位之一，它在水溶性酚酸类化合物的活性成分中含量高于50%〔4〕。以往研究显示Sal B具有抗氧化、对抗β淀粉样蛋白诱导的细胞毒性、促进血管内皮增殖等功能〔5〕。钟静等〔6〕报道Sal B能够促进脑缺血后海马齿状回颗粒下层和侧脑室下层神经干细胞增殖和分化，在脑缺血损伤中发挥重要的保护作用。张敏等〔7，8〕报道Sal B可以上调血管内皮生长因子的mRNA水平和蛋白水平，能够保护血管性痴呆动物模型的学习记忆能力。

本实验表明Sal B可以改善AD模型大鼠的空间学习记忆能力(P＜0.01)，其机制可能是通过改善AD模型大鼠的抗氧化应激和抗凋亡能力来实现的。本实验为进一步研究AD的治疗提供了理论和实验依据。

1 Ballard C，Gauthier S，Corbett A，et al.Alzheimer's disease〔J〕.Lancet，2011;377(9770):1019-31.

2 岳喜典，曲桂武，李桂生，等.丹参酚酸B在水溶液中的稳定性研究〔J〕.中草药，2005;36(2):205-7.

3 徐建民俞海燕.不同剂量的东莨菪碱对大鼠学习记忆能力的影响〔J〕.苏州大学学报:医学版，2006;26(1):53-4.

4 Tang MK，Zhang JT.Salvianolic acid B inhibits fibril formation and neurotoxicity of amyloid beta-protein in vitro〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2001;22(4):380-4.

5 Zhang RL，Zhang ZG，Zhang L，et al.Proliferation and differentiation of progenitor cells in the cortex and the subventricular zone in the adult rat after focal cerebral ischemia〔J〕.Neuroscience，2001;105(1):33-41.

6 钟 静，唐民科，张 妍，等.丹酚酸B对脑缺血再灌注大鼠神经细胞损伤和神经发生的影响〔J〕.药学学报，2007;42(7):716-21.

7 张 敏，李永江，陈 粲.丹银提取物对VD模型大鼠学习记忆和海马VEGF表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(7):2700-1.

8 薛 亮，范英昌，李庆雯，等.丹酚酸B对离体培养内皮祖细胞VEGF、bFGF mRNA表达及抗氧化酶活性的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(1):236-8.