花粉壁发育研究进展*

朱骏 杨仲南

①讲师，②教授，上海师范大学，生命与环境科学学院，上海 200234

1 引言

被子植物的个体发育包括种子的形成、种子的萌发和幼苗成长为成熟植株等营养生长过程，以及开花授粉受精等生殖发育过程，形成孢子体—配子体—孢子体的世代交替。开花植物的授粉过程不仅是有性生殖的必要途径，也是进化及对环境适应的基础之一。花粉壁是花粉粒表面的一层坚硬而具有粘性的结构，在保护花粉免受环境破坏、促进花粉与昆虫以及花粉与柱头之间的附着与识别等方面具有重要作用；因此花粉壁的发育是植物保证有性生殖的重要一环，对花粉壁发育的研究具有重大的理论意义。目前的研究表明，多数雄性不育的性状都与花粉壁的不正常发育相关。

2 被子植物花粉壁概述

2.1 花粉壁的结构

在花药的发育过程中，花粉粒的花粉壁沉积是最重要的事件之一。花粉壁是一层由孢粉素和纤维素组成的特殊的细胞壁，其理化性质非常稳定。花粉壁在发育过程中维持小孢子膜的稳定[1-2]，使得小孢子经过两次有丝分裂发育成为成熟花粉后，在脱离孢子体期间能够保持水分维持其生殖活性，并抵御各种物理、化学及生物因素的侵扰。此外，花粉壁还参与授粉后花粉与柱头相互识别的过程[3]。花粉壁的结构和成分远比一般的植物细胞的细胞壁复杂，后者主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成。花粉壁分为花粉内壁(intine)和花粉外壁(exine)两层，其中外壁又分为两层：有蜂窝状的外壁外层(sexine)以及平坦的外壁内层(nexine)。外壁内层是在初生外壁降解以后形成的，作为外壁发育的骨架。外壁外层由网格状结构的柱状层(bacula)和顶盖层(tectum)构成(图 1)。花粉外壁的成分主要由绒毡层细胞合成并分泌在药室中，沉着在小孢子表面后形成高度复杂的网状结构。花粉壁内壁相对简单，成分主要是纤维素、果胶和蛋白质[4]。花粉外壁外还覆盖有一层脂质复合物，名为含油层(tryphine)或者花粉包被(pollen coat)，对花粉的受精信号识别以及对柱头或昆虫的附着很关键[5]。

2.2 花粉壁的成分

花粉外壁的化学成分主要为极端抗腐蚀的孢粉素类物质(sporopollenin)，是由一些长链脂肪酸、氧化芬芳环以及苯基丙酸类物质聚合而成[6]。最近一些研究结果使人们对另两种由芳香族多聚物构成的细胞外基质成分的结构及其生物合成的过程有了更深刻的认识。然而，由于小孢子和成熟花粉粒的发育过程中合成的细胞外基质成分太少，并且对花粉外壁成分的分析存在诸多的技术局限，因此人们对花粉外壁以及孢粉素多聚物单体及其结构的了解非常有限[7-8]。从其他物种已知的信息中发现孢粉素多聚体的主要单体成分是无分支的多羟基长链或极长链的脂肪酸，以及氧化的芳香族复合物。由于分离的孢粉素很难进行化学降解，孢粉素的天然结构以及单体构成仍然没有确定[9]。有证据表明早期陆生植物的小孢子壁(例如苔藓植物石松)和被子植物的花粉壁的化学成分相似。因此，6亿年前至4.5亿年前的第一批陆生植物对地球环境的开拓使它们获得了产生孢粉素多聚体来保护单倍体小孢子的能力。孢粉素可能是第一种开始进化的植物多聚酯类细胞外基质[10]。

图1 花粉壁的结构

3 绒毡层及其决定基因在花粉壁形成过程中的作用

3.1 绒毡层提供了花粉壁合成的原料

绒毡层位于花药壁四层孢子体细胞的最内层。早在20世纪60年代，Heslop-Harrison发现矮雪轮(Silene pendula)绒毡层细胞中的电子致密物质聚集成斑块状，最终作为孢粉素原料运输到小孢子表面[11]。在百合中的观察也发现脂类物质在绒毡层中形成，逐渐转移到细胞膜外聚合形成乌氏体作为花粉外壁的原料[12]。随着分子生物学的发展，研究人员发现绒毡层特异启动子启动的核糖核酸酶会导致转基因植株表现出花粉完全败育的性状[13]，这个结果从分子水平上阐明了绒毡层对于花粉形成是不可或缺的一环。在拟南芥中，绒毡层从花药原基的L2细胞层发育而来，到花药发育第5期形成明显的绒毡层结构[14]。在减数分裂期间，绒毡层细胞的细胞质变得浓密，进行核内有丝分裂，形成双核的、缺少初生壁的极性分泌细胞[15]，其中充满了核糖体、线粒体、内质网及高尔基体等细胞器，显示其代谢高度活跃。减数分裂完成后，小孢子外的胼胝质壁在绒毡层分泌的胼胝质酶作用下降解，小孢子从四分体中释放出来并开始发育成熟。花药绒毡层通过细胞内切面释放小孢子发育所需要的蛋白质、脂类及其他营养物质[16]。在花粉第一次有丝分裂完成时，绒毡层明显开始降解，通过将自身的质体转化为造油体以及较大的细胞质含油体。这些物质在绒毡层降解后释放到药室内，积累在成熟花粉的表面形成一层复杂的脂质包被[5]。

3.2 绒毡层发育关键基因以及遗传通路

目前发现有多个转录因子在绒毡层细胞形成后对其发育和功能起着重要的调控作用。DYT1编码一个在花药发育早期表达的 basic helix-loop-helix(bHLH)家族转录因子，控制着相当多的绒毡层特异基因的表达[17]；TDF1则编码一个R2R3 MYB家族转录因子参与绒毡层的早期发育[18]；转录因子AMS也属于bHLH家族转录因子[19-20]。这些基因的突变体中绒毡层细胞能够形成，但随即出现异常空泡化并且肥大，向药室内部挤压，导致小孢子提前降解。DYT1的表达高峰出现在花药发育的第5期，表明DYT1在绒毡层细胞命运决定后首先发挥功能。TDF1的表达高峰则出现在DYT1之后(第6期)，而且定量RT-PCR和原位杂交实验结果显示该基因处于DYT1的下游。AMS基因的表达主要集中在第6期和第7期的绒毡层细胞中，定量RT-PCR和原位杂交实验显示其定位在TDF1的下游[21]。这表明三个早期表达的转录因子依次启动来调控绒毡层的发育。在绒毡层后期的生物学功能研究中，MYB家族MYB103基因的表达在第7期的绒毡层中非常特异，该基因的突变导致花粉外壁外层不能形成，表明MYB103是调控花粉外壁外层合成的特征基因[22]。MS1则编码一个具有PHD-finger结构域的转录因子，该基因在花药第9期表达才到最高峰，与前几个转录因子相差较远。ms1突变体的绒毡层细胞直到在四分体释放后的小孢子发育阶段，才显示出较为明显的空泡化现象，其小孢子外壁结构异常但依然存在表明其功能可能受到了部分的影响，这些结果说明MS1的主要功能在于后期对绒毡层功能调节和细胞凋亡机制的启动[23-24]。最近，本实验室通过定量RT-PCR与原位杂交，以及双突变体遗传分析等方法表明这些转录因子在遗传上存在着上下游的关系(DYT1-TDF1-AMS-MYB103-MS1)[21]。这条遗传通路通过MYB103调控花粉外壁外层的形成。此外，在绒毡层的发育过程中，甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase)家族的两个成员AtGPAT1及AtGPAT6参与调控甘油酯生物合成的第一步，这两个基因的突变体中绒毡层细胞的内质网形态异常，绒毡层的分泌功能受到影响，导致半不育的表型[25-26]。

4 花粉外壁的形成依赖于孢粉素的合成与运输

目前一些研究发现了一个可能存在的孢粉素代谢途径：首先，在绒毡层质体中形成的脂肪酸经过脂肪酸乙酰辅酶 A合成酶(Acyl-CoA synthetase5)(ACOS5)的修饰后转运到内质网上。ACOS5在花药绒毡层特异表达，其产物对于油酸(C18:1)有较强特异性，而不是羟基肉桂酸，表示该蛋白并不是一个4-香豆酸辅酶A连接酶。这些结果表明ACOS5参与到花药发育中与孢粉素合成相关的中链脂肪酸(C8到C16)的代谢过程。该基因的突变导致孢粉素合成途径被抑制，小孢子外壁缺失导致花粉败育[27]。随后，这些辅酶A化的酯类被拟南芥的细胞色素P450酶CYP703A2进行内羟化。CYP703A2的敲除突变体有部分雄性不育的表型，且缺少成熟的花粉外壁，这显然是因为缺少孢粉素造成的[28]。CYP703A2专一地作用在可能为孢粉素前体的7-羟基月桂酸(C12)。其在苔藓植物和陆生植物进化上的高度保守表明这个酶参与了一个很古老且保守的孢粉素合成的生化途径[28]。同样在拟南芥中，CYP704B1也催化了脂肪酸链的内羟化，但其底物为质体合成的 C16 及 C18脂肪酸，其突变体也有与cyp703a2相似的表型[29]。接着，这些羟基化的脂肪酸被脂肪酸还原酶male sterility 2(MS2)转化为脂肪醇，由一个 ABC转运蛋白(ATP binding cassette transporter, ABCG26) 运送出绒毡层以后到达小孢子表面进行聚合[30-32]。同时，有证据表明在苯丙醇的代谢途径中，有两个花药特异表达的编码查尔酮合成酶的基因(LAP5、LAP6)参与孢粉素前体的合成，它们将长链脂肪酸酰基辅酶A加入苯环转变为苯丙醇类物质[33]。

5 初生外壁(primexine)在花粉外壁形成中的作用

花粉外壁的前体来源于绒毡层，花粉外壁的沉积模式则依赖于小孢子母细胞所产生的初生外壁。初生外壁位于小孢子质膜与胼胝质层之间。减数分裂期间，小孢子母细胞会在细胞膜外分泌由β-1,3-葡聚糖组成的胼胝质层以取代原有的细胞壁。胼胝质具有将小孢子与花药孢子体细胞隔离、防止细胞融合以及防止小孢子过早发育等作用[34-35]。在拟南芥中，胼胝质合成酶基因callose synthase5(CalS5)在小孢子母细胞中高效表达，对四分体胼胝质层的合成起主要作用。在该基因的敲除突变体中，小孢子周围的胼胝质合成量降低，导致初生外壁形成缺陷，随后的花粉外壁沉积也受到严重影响，这表明了胼胝质层作为初生外壁形成的模板在随后的花粉壁发育中有极其关键的作用[36-37]。

初生外壁的成分来源于小孢子，由多聚糖、纤维素以及一些蛋白组成[38], 其沉积模式决定了随后花粉外壁的结构模式，是花粉外壁形成的蓝图[39]。初生外壁在减数分裂后的小孢子表面出现，位于胼胝质层与质膜之间。随后小孢子质膜开始产生明显的波浪型，此时的初生外壁基质紧靠着胼胝质层。纤维性原料开始填充在初生外壁上，逐渐在质膜的波浪型顶端形成棒状前体。这些棒状前体将决定花粉外壁的沉积模式[40-41]。因此，花粉外壁的形成不仅依赖于初生外壁，与小孢子质膜也有关系。一种说法认为，波浪型的质膜结构扩展了细胞周质间隙，形成了初生外壁物质积累的空间[42]，此种类型的质膜中的细胞骨架、内质网和液泡可能与初生外壁的精确定位相关[43]。另一种说法则认为，初生外壁成分从小孢子释放出来，对于小孢子质膜表面的渗透压产生影响，造成了细胞骨架的拉伸，从而导致质膜的波浪型和初生外壁的间隔分布[44]。

目前在拟南芥中发现了4个蛋白与初生外壁的形成相关。在defective in exine formation1 (dex1)和no exine formation1(nef1)突变体中，孢粉素前体虽然能由绒毡层正常分泌，但是单倍体小孢子表面初生外壁沉积被延迟，而且厚度也变薄。随后的前柱状体(probacula)不能形成，导致孢粉素无法正常积累在小孢子表面。伴随外壁构建的缺陷，突变体的小孢子也进而降解。DEX1编码一个具有钙结合结构域的未知蛋白[45]，而NEF1基因编码一个可能在绒毡层质体内膜定位的蛋白质[1]。RUPTURED POLLEN GRAIN1(RPG1)编码一个 MtN3/saliva家族蛋白，该家族蛋白通常是膜整合蛋白，并含有两个拷贝的 MtN3/saliva结构域，该基因的突变体导致花粉壁结构产生明显缺陷，没有正常花粉的网格状结构，而只有点状的脂类物质分布。透射电镜揭示rpg1突变体中花粉壁的早期决定出现问题，造成花粉壁构建时期孢粉素不能正确沉积在花粉表面从而导致花粉壁异常[2]。最近的研究表明，RPG1作为一个糖转运蛋白来执行生物学功能，这进一步表明了初生外壁的单体主要由糖类所聚合而成[46]。NO PRIMEXINE AND PLASMA MEMBRANE UNDULATION(NPU)基因编码一个有两个跨膜结构域的未知功能膜蛋白。该基因的缺失突变体表现为初生外壁的积累以及小孢子细胞膜的波浪型完全丧失。因此该突变体初生外壁的缺陷比以上三个突变体更为严重[47]。这些基因的克隆有助于花粉外壁发育模式的分子机理的深入研究。

6 花粉内壁的合成过程由配子体控制

在小孢子释放之后，由孢子体合成的花粉外壁沉积在初生壁上，在小孢子和雄配子发育时，由果胶构成的花粉内壁在花粉内合成[38]。近来有一些编码和花粉内壁形成有关的纤维素合成酶的基因(cellulose synthase)CESA被克隆，其中cesa1及cesa3的敲除突变体表现为配子体不育表型，并且可以看到花粉壁的形成都发生异常，此外功能冗余的CESA2、CESA6及CESA9基因的三突变体也有相似的表型[48]。此外，拟南芥中AtUSP是一个编码 UDP-sugar焦磷酸化酶的基因，突变体表型为外壁正常，而败育的小孢子内壁特异缺失，其突变体同样表现出配子体败育表型，这些结果表明花粉内壁合成确实由小孢子自身调控[49]。

以上这些花粉成熟过程障碍或花粉壁形成缺陷的拟南芥雄性不育突变体帮助我们阐明了花粉壁模式形成，孢粉素生物合成与积累过程中的细胞生物学及生化机制。

7 结语

植物花粉外壁的形成是一个复杂的生物学过程，依赖于小孢子自身和花药绒毡层的共同作用，其过程严格地受到许多基因的调控。这些基因通过在不同时空上的特异表达实现对胼胝质及初生外壁的合成、孢粉素合成、运输和沉积等一系列重要生命过程的精确控制，从而控制花粉壁的形成。尽管这些基因的功能已经得到了一定的了解，但各个基因在遗传和生化水平的上下游关系尚不清楚。因此，对已知基因进一步系统的研究以及挖掘新的参与花粉壁发育的调控位点将使这些独立分散的知识系统化，以便能更好地阐明花粉壁发育的分子机理。

(2012年12月3日收稿)

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