华北大黑鳃金龟气味结合蛋白HoblOBP2的生物信息学分析

庄绪静， 尹 姣， 李克斌， 曹雅忠

（中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193）

昆虫在复杂多变的环境中能够准确而迅速地对配偶及寄主植物进行定位及选择，主要是由于昆虫与昆虫之间，昆虫与植物之间存在着复杂的信息交流，传递这些信息的气味化合物就是昆虫与昆虫或者昆虫与植物之间的化学语言，与此相适应，昆虫在长期进化过程中形成的对气味物质高度特化的感觉器官及感应机制，能识别环境中特异的化学气味分子。触角就是昆虫重要的嗅觉器官，对气味分子具有识别和鉴定的作用。其中，气味结合蛋白（odorant binding protein，OBP）是气味分子进入触角后遇到的第一个蛋白，气味物质多为脂溶性小分子化合物，这些气味物质通过扩散的方式穿过触角上皮细胞之间的孔道到达嗅觉感受器的淋巴液中，但这些脂溶性物质不能直接通过淋巴液的液体环境，气味结合蛋白在气味物质的传递过程中起着重要的作用［1－2］。

国内外学者对昆虫气味结合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）已开展了大量的研究，目前认为它是一类相对低分子质量（15 000左右）、等电点偏酸性（pH 4.0～5.0）、球状的水溶性蛋白，多肽链全长约120～160个氨基酸，由6～7个α螺旋组成，N末端有一段20个氨基酸左右的信号肽，序列中有6个保守的半胱氨酸形成3对二硫键［3］。其主要功能是运输脂溶性的气味物质，通过嗅觉淋巴液到达神经树突膜上的受体，从而使昆虫产生嗅觉反应。

在OBPs功能研究中，气味结合蛋白的三维结构及其与其配体分子之间的结合机制研究是目前研究的热点。通过X衍射方法，首先解析了果蝇的普通气味结合蛋白（LUSH）与乙醇的晶体结构，明确Thr57是结合的关键位点［4－5］。Sandler等［6］对家蚕信息素结合蛋白（BmorPBP）与蚕蛾性诱醇的结构进行X衍射后发现，蚕蛾性诱醇在蛋白的活性区域内与蛋白通过氢键和疏水作用相互作用，其中与氨基酸残基Ser56形成的氢键起着关键作用。2011年，毛杨等人对致倦库蚊气味结合蛋白CquiOBP1与MOP的结构研究发现，其相互作用力是范德华力和疏水作用而非氢键［7］。

金龟子属于鞘翅目金龟甲类昆虫，全世界约有3.5万种，我国已记录的约有1 800种［8］，其幼虫－蛴螬具有种类多、分布广、食性杂、生活隐蔽、适应性强、生活史长短不一等特点，是国内外公认的难以防治的土栖性害虫。不同于幼虫的地下为害，成虫取食、交配及产卵等活动多在地面进行，因而从成虫入手是针对金龟子类昆虫简便而有效的防治途径，其中利用昆虫的嗅觉控制害虫数量是一项较为可行的措施，这类环境友好型防治措施对于防治金龟子具有广阔的应用前景。

本文对华北大黑鳃金龟气味结合蛋白HoblOBP2进行同源建模，模拟蛋白的三维结构，并利用分子对接技术对HoblOBP2与其特异气味分子苯甲酸己酯进行对接，以期解析HoblOBP2与气味分子之间的结合机制，并明确HoblOBP2结合气味分子的特异性位点。

1 材料与方法

1.1 材料

HoblOBP2的序列来自GenBank，登录号为GQ856257。三级结构可视化软件SwissPdb－Viewer（SPDBV）。

1.2 蛋白质序列的基本性质分析

应用EMBOSS6.3.1软件包的pepstats程序分析HoblOBP2的氨基酸残基数量、等电点和相对分子质量，tmap程序查看蛋白质是否有跨膜区，使用ExPASy平台中的SignaIP 3.0Serve程序（http：∥www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）软件预测蛋白质氨基酸序列的信号肽位置。

1.3 HoblOBP2的同源建模与模型分析

通过Blast搜索选择建立模型的合适模板，在同源建模服务器 SWISS－MODEL［9］（http：∥swissmodel.expasy.org／），对去掉信号肽的 HoblOBP2氨基酸序列进行建模，其结果用 DeepView［10］（Swiss Pdb－View mode）进行观察。利用同源建模方法获得该蛋白质的三级结构，然后用在线评价服务器PRO－CHECK对所建模型进行评价［11］。获得的HoblOBP2三维结构在SwissPdb－Viewer（SPDBV）中显示，并分析其结构特点。

1.4 HoblOBP2与苯甲酸己酯的对接及分析

由于配体小分子与受体蛋白质的结合是一个“动态契合”的过程，配体和受体的构象在结合前后会发生一定程度上的改变，而且目前大多数对接算法仅考虑配体的柔性而忽略受体的柔性，这往往会降低对接计算的准确性。另外，我们对接所采用的HoblOBP2蛋白的三维结构为同源模建结构，其精度要低于晶体结构，考虑受体活性位点的柔性将有利于得到更为合理的结果。因此，我们选用autodock／flexible residues模块来开展柔性分子对接研究，该对接策略能同时考虑受体活性位点和配体的柔性。

华北大黑鳃金龟两种气味结合蛋白OBP1和OBP2的功能研究已经深入开展。荧光竞争结合实验表明这两种蛋白对醇类、醛类、酯类、萜烯类、酮类化合物中的部分物质都有着较好的结合活性，其中对苯甲酸酯类的结合能力相对比较突出［5］，因此本试验选择苯甲酸己酯作为分子对接的配体分子。

首先，利用chemoffice 2004模拟苯甲酸己酯的三级结构，然后应用Autodock4.0软件将苯甲酸己酯与HoblOBP2蛋白的三维结构进行分子对接。对接后的结合产物在SwissPdbViewer中显示，并且分析HoblOBP2结合气味分子的分子机制及关键结合位点。

2 结果与分析

2.1 蛋白质序列的基本性质分析

HoblOBP2相对分子质量为17 435.00，共159个氨基酸残基，各种氨基酸含量如表1所示；理论等电点为5.028 2，带电荷氨基酸残基（Asp＋Glu＋His＋Lys＋Arg）共44个，酸性氨基酸残基（Asp＋Glu）为23个，包含1个跨膜区，即4～27位氨基酸残基，序列为 HSITGFKMKYFVVFAALCAYVLGD，见图1。还包含由26个氨基酸残基组成的信号肽。

图1 HoblOBP2跨膜区预测结果Fig.1 Prediction of transmembrane domain of HoblOBP2

表1 HoblOBP2氨基酸组成Table 1 Amino acid composition of HoblOBP2

2.2 HoblOBP2的同源建模与模型分析

在Protein Data Bank中对HoblOBP2序列进行Blast搜索，结果显示有6种已知结构的昆虫气味蛋白与其序列相似，这6种气味结合蛋白分别为：家蚕（Bombyx mori）PBP（BmorPBP）、冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）OBP17（AgamOBP17）、家蚕（Bombyx mori）GOBP2（BmorGOBP2）、脐 橙 螟（Amyelois transitella）PBP1（AtraPBP1）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）OBP1（AaegOBP1）、多音大蚕（Antheraea polyphemus）PBP（ApolPBP）和意大利蜜蜂（Apis mellifera）PBP （AmelPBP）。以 AtraPBP1为模板（相似度最高）同源建模后可以清晰地观测到HoblOBP2的三维结构（图2），将构建好的结构模型同样用Pro－CHECK检测评估分析发现，如图3所示，模建蛋白90.8%的残基落在最佳区域（红色区域A，B，L），7.3%的残基落入其他许可区（亮黄色区域a，b，l，p），1.9%的残基落在勉强许可区（淡黄色区域－a，－b，－l，－p），0.0%的残基落在不允许区，落在最佳区域的残基为90.8%，大于90%，说明构建的HoblOBP2属于高质量的模型，是准确可靠的。

图2 HoblOBP2的三级结构Fig.2 Tertiary structure of HoblOBP2

其具有昆虫普通气味结合蛋白的典型结构特点，包括6个α螺旋，分别由9－25（α1），30－36（α2），44－55（α3），68－73（α4），86－95（α5）和106－120（α6）位氨基酸组成。6个保守的半胱氨酸残基形成3对二硫键起着稳定蛋白质结构的作用，二硫键CYS21－CYS52连接 α1 和 α3，CYS48－CYS107 连接 α3 和α6，CYS96－CYS116连接α5和α6。5个反向平行的α螺旋（α1、α3、α4、α5和α6）形成了 HoblOBP2蛋白内部结合口袋，α2不参与口袋的形成，但是它在口袋的另一端像一个盖子一样盖在口袋上方。较长的C－末端折合进入蛋白质口袋内部，使得口袋更加稳固。

图3 预测的HoblOBP2的三维结构Fig.3 Predicted 3Dmodel of HoblOBP2

蛋白质结合口袋内的氨基酸残基大部分是疏水性的，例如ILE58，LEU61，ILE66，PRO67，GLY72，LEU73，VAL75，VAL76，CYS132，GLY136，VAL137和VAL140。也有一部分亲水性残基如THR54， ASP57， GLN65， SER69， SER77和LYS141。

2.3 HoblOBP2与苯甲酸己酯的对接结果

为了更好地研究HoblOBP2结合气味分子的特性，选择与HoblOBP2结合能力较强的苯甲酸己酯（图4）与已经构建的HoblOBP2三维模型进行对接，对接结果如图5所示。我们发现，蛋白质与配体分子之间并没有形成氢键，主要是通过范德华力和疏水作用而相互作用的。在HoblOBP2蛋白结合活性区域，与苯甲酸己酯分子距离小于4Å的残基有THR54，ASP57，ILE58，LEU61，GLN65，ILE66，PRO67，SER69，GLY72，LEU73，VAL75，VAL76，GLY136，VAL137和VAL140，其中距离最近的是LEU73（2.10Å），在该位点与苯甲酸己酯的范德华力最大（图6），它可能与HoblOBP2结合气味分子的特异性有关。虽然蛋白质与苯甲酸己酯之间没有氢键形成，但是我们发现在蛋白质活性区域内有蛋白分子内氢键的形成，如图7所示，在蛋白口袋的内部，靠近苯甲酸己酯苯环 的 一 端，THR54：H－ASP57：O，THR54：OASP57：HN和 THR54：O－ILE58：HN 形成三对分子内氢键锁住苯甲酸己酯分子。在蛋白C末端，VAL137：HN－CYS133：O和 VAL137：O－LYS141：HN形成两对分子内氢键锁住苯甲酸己酯。在AgamOBP1，AaegOBP1及CquiOBP1·MOP中都有类似的 C－末端结构［7，12－13］。由此，推测均能形成双氢键的THR54与VAL137位点可能是HoblOBP2结合气味分子的关键位点。

通过以上预测分析，LEU73、THR54与VAL137可能是华北大黑鳃金龟气味结合蛋白HoblOBP2结合气味分子的活性位点。

3 讨论

对大黑鰓金龟的气味结合蛋白同源建模后发现，其三维预测结构主要由6个α螺旋构成，存在3对二硫键，分别是二硫键CYS21－CYS52连接α1和α3，CYS48－CYS107连接α3和α6，CYS96－CYS116连接α5和α6，这5个α螺旋形成疏水口袋，二硫键起着稳定蛋白质结构的作用，只有α2不参与疏水结合口袋的形成，而是像一个盖子一样在口袋的另一端，这与东亚飞蝗LimgOBP1［14］的三维结构中口袋的形成是相同的。与此稍有不同的是，在家蚕BmorPBP的三维结构中，由4个反向平行的α螺旋（α1，α4，α5，α6）形成疏水口袋，α2和α3不参与口袋形成。因此，我们推测不同昆虫气味结合蛋白三维结构疏水结合口袋的形成是有一定的差异的，可能与其功能密切相关。

华北大黑鳃金龟两种气味结合蛋白OBP1和OBP2的功能研究已经深入开展。荧光竞争结合实验表明这两种蛋白对醇类、醛类、酯类、萜烯类、酮类化合物中的部分物质都有着较好的结合活性，其中对苯甲酸酯类的结合能力相对比较突出［15］，因此本试验选择苯甲酸己酯作为分子对接的配体分子。

目前普遍认为气味结合蛋白结合与释放气味分子的过程与气味分子自身的构象、触角感器淋巴液的pH和神经元树突膜附近的盐离子浓度有关，并且不同昆虫的气味结合蛋白的结合、释放配体的机制存在差异［16］。比较经典的蛋白与配体分子的结合理论是家蚕信息素结合蛋白BmorPBP与信息素的结合／释放过程。研究表明，家蚕信息素结合蛋白BmorPBP的构象随pH的改变而变化，当pH为6.5并有其信息素蚕蛾醇存在时，BmorPBP是“紧口”构型，是可以结合配基的；当pH为4.5时，BmorPBP为“开口”构型，BmorPBP1的C末端折叠形成第7个α－螺旋并占据结合腔内部，这被认为能够在PBP／配体复合物到达气味受体时促使信息素分子从结合腔内释放；当没有蚕蛾醇存在时，C末端氨基酸形成α－螺旋替配基的位置占据结合腔，而在pH为7.0时C末端并不形成α－螺旋［17－18］。但是由于氨基酸序列的差异，某些昆虫的蛋白结构会略有不同，如马德拉蜚蠊（Leucophaea maderae）的OBP的C末端部分很短，进入疏水腔时并不形成α－螺旋，而是与腔内的氨基酸形成疏水键［19］。双翅目昆虫果蝇的LUSH，冈比亚按蚊OBP1，埃及伊蚊OBP1，致倦库蚊OBP1和膜翅目昆虫意大利蜜蜂（Apis mellifera）ASP1被称为中等长度PBP，其序列长度介于鳞翅目昆虫和蟑螂的气味结合蛋白之间，解析这些气味结合蛋白的结构发现它们的C端会折叠并进入蛋白核心区域，但并没有形成α－螺旋，而且在结合配体时，C端也没有被置换出来［4，7，12－13］，通过对华北大黑鳃金龟触角气味结合蛋白OBP2的结构进行分析发现，此蛋白的C末端也属于后一种情况，即折叠并进入蛋白核心区域，但并没有形成α－螺旋，在结合配体时，C端也没有被置换出来，由此可以推出，华北大黑鳃金龟触角气味结合蛋白OBP2结合释放气味结合蛋白的机制与家蚕BmorPBP与信息素的结合／释放过程是不同的。

分析蛋白内部及蛋白与气味化合物之间的结合特性发现，在HoblOBP2蛋白C末端的α6螺旋上，氨基酸残基VAL137与CYS133和LYS141分别形成两对分子内氢键可以像锁一样锁住苯甲酸己酯。这种特殊的C末端结构在其他一些昆虫气味结合蛋白上也有一些报道，例如：AgamOBP1三维结构的C－末端上Val125分别与His23和Tyr54形成分子内氢键；对于AmelASP1，在低pH时，靠C末端的Val118与Asp35形成分子内氢键固定住气味分子。因此，我们推测在HoblOBP2结合与释放气味分子的过程中，C末端可能起着重要的作用。

毛杨等［7］人对致倦库蚊气味结合蛋白Cqui－OBP1与MOP结合特点研究时发现，其相互作用力并不是氢键和疏水作用而是范德华力和疏水作用。范德华力（又称分子作用力）产生于分子或原子之间的静电引力，没有方向性和饱和性，其主要作用范围在1～4Å（1Å＝0.1nm），与分子间距离的6次方成反比，即随着分子间距离的增大而迅速减小，距离越近作用力越大。根据HoblOBP2与苯甲酸己酯的分子对接结果分析，在与苯甲酸己酯分子距离小于4Å的所有残基中，LEU73（2.10Å）是距离最近的，所以LEU73与苯甲酸己酯之间的范德华力是最大的。

通过生物信息学研究，预测Leu73、Thr54和Val137均可能与HoblOBP2蛋白特异性结合气味分子有关，至于哪个氨基酸残基是关键结合位点，需要进一步通过定点突变技术，在突变蛋白经过体外诱导表达及纯化之后进行荧光结合试验来验证。

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