TGF-β1和endoglin在乳腺癌发生发展过程中的表达及意义

王娅南 徐芳 李玉兰 张顺

乳腺癌是当今世界女性最多发的恶性肿瘤，自20世纪以来，国内外乳腺癌发病率无论是发达国家还是发展中国家，始终处于不同的上升状态，乳腺癌其侵袭性和转移性是导致肿瘤患者死亡的主要原因［1］。乳腺癌的发生、发展与血管生成密切相关，抑制血管生成成为治疗乳腺癌的一个重要研究方向。血管的形成是一个复杂的过程，因而探讨众多因素中相互关系，有利于各种血管相关因子地位与主次之分，对于获取有价值的干预靶位具有肯定价值。因此，本研究采用RT-PCR和免疫组织化学的方法检测TGF-β1和endoglin mRNA和蛋白在乳腺正常组织、非典型性增生、原位癌及浸润性癌组织中的表达变化，旨在讨论两者在乳腺癌发生发展过程中的作用，为进一步寻找关键靶位提供参考和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 取自2008至2010年我院病例，经由病理医师复审病理切片。临床资料和蜡块保存完整，共210例，其中正常乳腺30例，非典型性增生50例，原位癌50例，浸润性癌80例。病理分类依据世界卫生组织(WHO)2004年病理分型标准。

1.2 试剂 鼠抗人endoglin一抗，鼠抗人TGF-β1一抗，SP二抗试剂盒(北京中杉生物公司);Taq酶，dNTPs和引物(endoglin上游 引 物 5 ＇-CGCCGCCACATCAGAAGGCTG-3 ＇，下 游 引 物 5 ＇-CTTTGGTCCAGTCACACCTT-3＇，GAPDH 上游引物 5＇-TGCTGAGTATGTCGTGGAG-3＇，下游引物 5＇-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3＇，扩增子分别为805 bp，288 bp)，MMLV 第一链 cDNA 合成试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)。

1.3 实验步骤

1.3.1 免疫组织化学染色：参照北京中杉公司SP两步法进行免疫组织化学染色，所有切片均同一批完成，以保证实验条件相同。阴性实验对照：0.01 mol/LPBS代替一抗。

1.3.2 RT-PCR反应：①RT反应用M-MuLV RT酶为反转录酶，反应体系为 20 μl，37℃，1 h，70℃，10 min。 -20℃ 保存。②PCR反应：在反应体系中加入 cDNA 2.5μl，上下游引物(20 pmol/L)各 1 μl，总体系 25 μl。endoglin反应参数：94℃5 min，30 个循环(94℃45 s，58℃45 s，72℃ 1 min)，72℃7 min。GAPDH 反应参数：94℃5 min，30 个循环(94℃45 s，54℃45 s，72℃45 s)，72℃7 min。凝胶成像系统扫描照相并进行电泳条带的分析，测量每一条带的密度，并将其与内参(GAPDH)的吸光度相比，求相对的量。

1.4 统计学分析应用SPSS12.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验和相关分析，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Endoglin蛋白的阳性信号主要定位于新生的内皮细胞的胞浆，且新生血管分布不均匀，大多数局限于肿瘤实质边缘的间质内。新生血管呈点、线、簇状结构，有管腔样结构形成，腔不规则，壁薄而无平滑肌形成。Endoglin蛋白在乳腺癌中的阳性表达率与患者年龄及肿瘤大小无关(P＞0.05)。Endoglin蛋白在正常组、不典型增生组、原位癌及浸润性癌组的表达，两两比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1，图1。

2.2 TGF-β1蛋白阳性表达主要定位于癌细胞胞质内，且在癌巢边缘的癌细胞表达较强，大部分血管内皮细胞也有阳性表达。在正常乳腺组TGF-β1蛋白表达于少量血管内皮细胞;在非典型性组表达于异常增生的腺上皮细胞及新生的血管内皮细胞上。见图1。

2.3 Endoglin mRNA在正常组、不典型增生组、原位癌及浸润性癌组的相对表达量分别为(0.33±0.19)、(0.78±0.51)、(1.35±0.91)、(3.85±0.87)，两两比较，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见图2。

2.4 不典型增生组、原位癌组及浸润性癌组中TGF-β1与endoglin蛋白标记的MVD值及mRNA表达值有显著相关性，TGF-β1蛋白表达阳性组中endoglin蛋白标记的MVD值及endoglin mRNA均显著高于TGF-β1表达阴性组(P ＜0.05)。见表1。

3 讨论

表1 不典型增生组和原位癌组及浸润性癌组中TGF-β1与endoglin蛋白标记的MVD值相关性比较±s

表1 不典型增生组和原位癌组及浸润性癌组中TGF-β1与endoglin蛋白标记的MVD值相关性比较±s

原位癌组(n=50) 26(+) 47.0±4.6 1.27±0.81 ＜0.05 24(-) 22.5±1.9 0.48±0.19浸润性癌组(n=80) 56(+) 69.5±7.3 4.03±1.11 ＜0.05 24(-)29.8±5.0 0.68±0.13

图1 免疫组化法TGF-β1与endoglin在乳腺浸润性癌组织中的表达

图2 endoglin的RT-PCR结果

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，在我国乳腺癌发病率居我国女性恶性肿瘤的第1位，死亡率占我国女性死亡率的第3位。乳腺癌的病因学是多因素的，涉及饮食、生育和激素失衡等。肿瘤的生长与血管形成关系密切［2］。血管形成(angiogenesis)是指机体生长发育过程中或创伤修复、缺血缺氧和炎症等情况下，原有微血管细胞(endothelial cell，EC)经过生芽、迁移、增殖与基质重建等形成新毛细血管的过程。肿瘤的生长可分为无血管期(avacular stage)或称血管前期(prevascular stage)和血管期(vascular stage)。无血管期的肿瘤主要依靠周围组织的弥散获取营养物质和排泄代谢产物，肿瘤细胞处于休眠状态，如果肿瘤细胞其增殖率和死亡率几乎相等，肿瘤体积难以超过1～2 mm3，也极少发生转移［3］。如果肿瘤超过这样的体积还缺乏新生的毛细血管和小血管长入，肿瘤组织将发生退化，一旦新生血管长入肿瘤组织，肿瘤就形成的自身的血管系统，即进入了血管期。此期的肿瘤局部有大量的新生血管形成，肿瘤细胞得到充分营养供应，肿瘤组织就会不可控制性生长及无限制扩张趋势，并向周围组织浸润，新生血管的基底膜不完整，血管通透性高以及新生血管的内皮细胞分泌胶原酶、纤溶酶和纤溶酶原激酶，在其作用下，肿瘤细胞极易穿透血管壁而发生周围组织的浸润和转移。因此，血管形成在肿瘤发生、发展过程发挥着重要的作用，关于肿瘤血管形成的机制一直是目前研究的热点问题。目前研究显示，TGF-β1可能参与了血管的形成［4］。在TGF-β1基因缺失时内皮细胞分化发生缺陷，形成不了足量的内皮细胞管并且管腔不完整。本实验发现TGF-β1蛋白在乳腺癌中的阳性表达率显著高于正常组、不典型增生组;同时浸润性癌组TGF-β1蛋白表达阳性率显著高于原位癌组;并且，免疫组织化学结果显示，TGF-β1蛋白阳性表达主要定位于癌细胞胞质内，且在癌巢边缘的癌细胞表达较强，大部分血管内皮细胞也有阳性表达，而在正常乳腺组TGF-β1蛋白表达仅于少量血管内皮细胞呈现阳性表达;在非典型性组表达于异常增生的腺上皮细胞及新生的血管内皮细胞上，提示在乳腺癌发生过程中，癌细胞能够合成TGF-β1，TGF-β1的阳性表达参与了乳腺癌的发生，可能是检测乳腺组织癌变的分子标志物。但其具体机制，目前尚不清楚。Endoglin又名 CD105，分子量为180 kD，由两个分子量为95 kD的单体组成的二聚体膜蛋白。Endoglin为内皮细胞上的一种抗原成分，与内皮细胞增生有关，对血管形成至关重要的。Miller等［5］通过检测肺癌细胞株和各种类型的内皮细胞株中endoglin mRNA的表达，结果发现所有肿瘤细胞株均未检测到endoglin mRNA，而所有的内皮细胞均表达一定数量的endoglin mRNA，这包括从肺癌组织中分离出来的内皮细胞，这一发现说明了endoglin选择性的表达于内皮细胞。

在乳腺不典型增生、原位癌和浸润癌组中，Endoglin mRNA及蛋白表达均与TGF-β1蛋白表达呈显著正相关，提示Endoglin和TGF-β共表达参与了乳腺癌癌变过程，可能具有协同作用。恶性肿瘤的MVD与肿瘤的生长、转移及预后有密切关系，肿瘤中血管的定量被认为是一种重要而独立的预后指标［6］。

目前用于标记肿瘤组织微血管的试剂主要为泛血管内皮细胞标记物CD31、CD34抗体及FⅧ-RA等，但它们在肿瘤组织的活性增生性微血管中的表达有时并不稳定，因而在判断MVD预后生存意义上存在差异。随着乳腺良性病变向乳腺癌方向的发展，血管不断形成和增生，血管密度也不断增加，特别在MDC阶段，说明一旦肿瘤细胞突破基底膜，瘤细胞更能刺激新生血管的生长，加速乳腺癌的浸润和转移［7］。乳腺癌发生侵袭、转移导致患者预后不良，当出现转移时，5年生存率由98%大幅下降至27%。如果在肿瘤发生时能控制早期癌，甚至是处在浸润性癌前期病变时就能控制病程发展，将会带来广阔的控制、治疗乳腺癌的前景。

1 Kim MS，You MK.Loquat(Eriqbotrya japonica)extracts suppress the adhesion，migration and invasion of human breast cancer cell line.Nutr Res Pract，2009，3：259-264.

2 田云霞，孟庆春，苑欣然，等.乳腺癌与相关危险因素的研究.河北医药，2012，34：1796-1797.

3 王纯，卢宏达.乳腺癌综合治疗的临床分析.中国全科医学，2011，14：3756-3757，3760.

4 陈晓燕，陈清化，林荣威.乳腺癌组织中生存素的表达与生物学行为的关系.中国基层医药，2012，19：1391-1392.

5 Miller DW，Graulich W，Karges B，etal.Elevated expression of endoglin a component of the TGF-beta-receptor complex，correlates with proliferation of tumor endothelial cells.Int JCancer，2009，81：586-572.

6 Abdalla S，Behzad F，Bsharah S，etal.Prognostic relevance of microvessel density in colorectal tumours.Oncol Rep，2008，6：839-842.

7 张江宇，王欣，朱彩霞，等.CD105在乳腺癌发生发展过程中的表达的研究.中华肿瘤防治杂志，2007，14：1472-1474.