纳米金催化光度法快速检测葡萄糖

邱 小 香

(1.渭南师范学院化学与生命科学学院，陕西渭南714000;2.陕西省多河流湿地生态环境重点实验室，陕西渭南714000)

0 引言

葡萄糖在医学上常被称为血糖，俗名又称玉米葡糖、玉蜀黍糖、右旋糖和葡糖等，分子式为C6H12O6，白色晶体，易溶于水.其结构式中含5个羟基和一个醛基，具有多元醇和醛的性质［1］.葡萄糖在工业、食品、药品上都有很多应用，所以对葡萄糖的定量分析有着很重要的意义.目前，用于检测葡萄糖的方法主要有高效液相色谱法、滴定法、气相色谱法、HPLC法［2］和生物传感器法，其中液相色谱法虽然具有较好的灵敏度，但排除干扰能力差;滴定法虽然操作简单，但是存在检出限低、误差大的问题;气相色谱操作比较复杂;HPLC法和生物传感器法的过程比较复杂，操作难度大.鉴于此，寻找一种快速、准确、简单的葡萄糖检测方法有着重要的意义.实验采用纳米金［3］催化葡萄糖与菲林试剂反应生成砖红色的氧化亚铜微粒，基于紫外—可见分光光度法建立了利用其吸光度值与葡萄糖浓度之间的线性关系来测定葡萄糖含量的方法.实验对反应温度、反应时间、纳米金的用量及菲林试剂(B)的用量等条件进行了优化.在最佳实验条件下，葡萄糖浓度在0.05～1.00 mg/mL范围内与吸光度值呈现良好的线性关系，线性回归方程为△A870nm=1.3674c葡萄糖+1.0848，相关系数 R2=0.991.该方法具有成本低、操作简单、灵敏度高等特点，并且用于注射剂中葡萄糖的检测获得了较好的结果.

1 实验部分

1.1 主要仪器与设备

HH－2数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)，UV－2000/2010紫外—可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)，电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司).

1.2 材料与试剂

1.2.1 试剂

葡萄糖(C6H12O6，天津登丰化学品有限公司)，酒石酸钾钠(KNaC4H4O6，天津致远化学试剂有限公司)，硫酸铜(CuSO4·5H2O，天津恒兴化学试剂制造有限公司)，抗坏血酸(C6H8O6，天津天泰精细化学品有限公司)，碳酸钾(K2CO3，天津市化学试剂厂)，氯金酸(AuCl3·HCl·4H2O，天津市光复精细化工研究所)，氢氧化钠(NaOH，西安化学试剂厂)，葡萄糖注射液(上海华源安徽锦辉制药有限公司).

实验所用试剂均为分析纯，所用的水都是二次蒸馏水.

1.2.2 纳米金的制备

纳米金的制备采用抗坏血酸还原法［5］.制备纳米金所用的玻璃仪器在使用前用铬酸洗液浸泡24 h，然后用二次水多次冲洗后烘干备用.取4℃冷却的含1%氯金酸的溶液1.00 mL，现配的0.2 moL/L的碳酸钾溶液1.50 mL及25 mL的水混合均匀，然后在其混合均匀后的溶液中边搅拌边加入含有0.7%的抗坏血酸溶液1.00 mL，溶液迅速变为紫红色，缓慢加热至溶液颜色变为亮红色.该纳米金的浓度为0.765 μg/mL.

1.2.3 菲林试剂的制备

菲林试剂(A):称取3.75 g的CuSO4·5H2O，加水溶解至100 mL(以硫酸铜计为0.15 moL/L);菲林试剂(B):称取酒石酸钾钠17.0 g溶解于20 mL的热水中，加入20%的氢氧化钠溶液20 mL，加水至100 mL(以酒石酸钾钠计为0.81 moL/L，含氢氧化钠6.1 moL/L).

1.3 实验原理及方法

1.3.1 实验原理

本实验基于葡萄糖的还原性，其与菲林试剂反应，生成氧化亚铜砖红色的沉淀.纳米金对这一反应有较强的催化作用［5－7］.氧化亚铜微粒在600～900 nm处有明显的吸收，且随着葡萄糖浓度的增加其吸光度值也随之增大(见图1c、d)，并在870 nm处呈良好的线性关系.根据葡萄糖浓度与吸光度值的线性关系及未知浓度葡萄糖溶液的吸光度值，计算出葡萄糖的浓度.

1.3.2 实验方法

在10 mL的比色管中，依次加入0.40 mL 0.15 moL/L菲林试剂(A)溶液，2.0 mL 0.81 moL/L菲林试剂(B)溶液，200 μL 0.765 μg/mL的纳米金，混合均匀后加入一定量的葡萄糖标准溶液，定容至10 mL.在70℃水浴中反应后流水快速冷却至室温，用分光光度计测得870 nm波长处的吸光度值，同时做空白试验.

2 结果与讨论

2.1 纳米金对葡萄糖—铜(Ⅱ)微粒反应的催化作用和吸收光谱

实验固定纳米金的用量、菲林试剂(A、B)的用量、葡萄糖的浓度、反应温度及反应时间，在600～900 nm的波长范围内，分别对菲林试剂—纳米金、菲林试剂—葡萄糖、菲林试剂—纳米金－4.46 mg/mL葡萄糖及菲林试剂—纳米金－5.08 mg/mL葡萄糖体系进行波谱扫描，结果如图1所示.

从图1可以看出，在实验条件下，纳米金对葡萄糖与菲林试剂的反应具有较强的催化作用(图1b、d)，葡萄糖和菲林试剂反应生成的氧化亚铜微粒在可见光区600～900 nm之间均有吸收，且样品与空白的吸光度值的差值在870 nm处较大，且具有良好的线性关系，故实验选取870 nm为测定波长.

图1 吸收光谱

2.2 反应条件的优化

2.2.1 菲林试剂(B)用量的优化

实验固定纳米金的用量、菲林试剂(A)的用量、葡萄糖的浓度、反应温度、反应时间，改变菲林试剂(B)的用量.在10 mL的比色管中先加入0.40 mL 0.15 moL/L的菲林试剂(A)，然后分别加入0.50 mL、0.80 mL、1.00 mL、2.50 mL、3.50 mL 0.81 moL/L 的菲林试剂(B)溶液，再加入 0.35 mL 0.765 ug/mL 的纳米金，混匀后加入0.20 mL 10.11 mg/mL的C6H12O6，70℃水浴加热4 min，流水冷却后测其870 nm处的△A值.根据菲林试剂(B)的用量和吸光度值的关系作图，结果如图2所示.

图2 菲林试剂(B)用量的影响

由图2可以看出，在其他条件不变的情况下，当菲林试剂(B)的用量在0.80 mL时△A的值最大.为了取得较大的吸光度值使实验具有更好的灵敏度及节约试剂，实验选用菲林试剂(B)的用量为0.80 mL.

2.2.2 反应时间的优化

固定葡萄糖的浓度(0.4044 mg/mL)、菲林试剂的用量(A:0.40 mL，B:2.00 mL)、纳米金的加入量(0.35 mL)及反应温度(70℃);控制反应时间分别为 1 min、3 min、5 min、7 min、9 min，流水冷却后测定870 nm处△A值.由吸光度值与时间作图结果为图3.

图3 反应时间的影响

由图3可以看出，在其他条件不变时，反应时间在1 min以内，反应几乎不发生;在1～3.5 min内吸光度值快速升高;3.5～4.5 min之间吸光度值有所下降;5 min以后吸光度值几乎不变.为了获得较大的吸光度值从而提高实验的灵敏度，同时减少因操作导致的反应时间上的差异对实验结果的影响，选择5 min作为最佳实验条件.

2.2.3 纳米金用量的优化

控制葡萄糖的浓度(0.4044 mg/mL)、菲林试剂的用量(A:0.40 mL，B:2.00 mL)、反应时间(5 min)及反应温度(70℃)不变，分别加入纳米金0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.35 mL、0.40 mL、0.50 mL，流水冷却后测得870 nm处的△A值.作图结果如图4.

图4 纳米金用量的影响

由图4可以看出，当加入纳米金的量在0.10～0.20 mL时吸光度值变化不大;纳米金的用量在0.20～0.50 mL之间随着纳米金的用量的变化△A的值先增大后减小，且用量在0.35 mL时△A的值最大.故实验中纳米金的用量应选取0.35 mL.

2.2.4 反应温度的优化

按照实验方法，在固定葡萄糖的浓度(0.4044 mg/mL)、菲林试剂的用量(A:0.40 mL，B:2.00 mL)、纳米金的加入量(0.35 mL)，分别在50℃、60℃、70℃、80℃水浴中反应3 min，测得吸光度值与温度之间的线性关系如图5所示.

图5表明，在常温下葡萄糖和菲林试剂几乎不发生反应;而温度从50℃ ～70℃变化时，吸光度值迅速增大，说明当温度在50℃ ～70℃之间时该反应在纳米金的催化作用下反应速率快速增大;当温度大于70℃后，反应速率虽然有所增加但增加的速度相对缓慢，说明此时纳米金的催化作用降低，而导致反应速率增大的原因主要是非催化作用，即温度对反应速率的影响.但温度过高也加快了氧化亚铜微粒之间的碰撞，从而导致大量的氧化亚铜微粒发生聚集而快速沉淀，导致△A870nm迅速降低［8］.为了取得较大的△A870nm值，减少产物体系的稳定性对实验结果的影响，实验选择70℃为最佳反应温度.

图5 反应温度的影响

2.3 标准曲线的绘制

按照实验方法，在最优实验条件下，保持菲林试剂的用量(A:0.40 mL，B:0.80 mL)、纳米金的用量200 μL，混匀后分别加入浓度为 10.11 mg/mL 的葡萄糖标准溶液 0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.90 mL，在最佳的反应温度(70℃)下，反应5 min后流水冷却至室温，应用上述建立的紫外—可见分光光度法测定其吸光度值.根据吸光度值和葡萄糖浓度的关系作图，结果如图6所示.由图6可以看出，葡萄糖浓度在0.05～1 mg/mL范围内与△A值呈现较好的线性关系，线性回归方程为△A870nm=1.3674C葡萄糖+1.0848，相关系数 R2=0.991.

图6 葡萄糖的浓度和吸光度值的线性图

2.4 样品测定

准确移取1.00 mL葡萄糖注射液，置于25 mL容量瓶中，加水稀释至刻度.在10 mL的比色管中加入菲林试剂(A)0.40 mL，菲林试剂(B)0.80 mL，纳米金200 uL，混匀后加入上述溶液1.00 mL，70℃水浴反应5 min，流水冷却后测其吸光度值.根据标准曲线得出溶液浓度.

2.5 加标回收试验

每组准确加入葡萄糖注射液的稀释溶液1.00 mL，分别加入浓度为10.11 mg/mL的葡萄糖标准溶液0.23 mL、0.41 mL、0.51 mL.在70℃水浴下反应5 min，流水冷却后测得吸光度值.计算回收率结果如表 1所示.结果表明，回收率为102.64% ～107.57%，说明该方法的准确度高.

表1 回收率试验结果

3 结语

实验结合纳米金对葡萄糖还原铜(Ⅱ)的反应具有较强催化作用、氧化亚铜微粒在870 nm处的特定吸收，建立了纳米金催化光度法测定葡萄糖的新方法.与其他方法比较，该方法所用试剂廉价、操作简单，用于葡萄糖注射液的测定，结果满意.

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