SSR 标记在杂交旱稻新组合纯度鉴定中的应用

张 琳，杜 鹃，齐丽霞，胡颂平* ，魏志刚，杨 莉，张安宁，刘国兰

(1.江西农业大学 理学院，江西 南昌330045;2.江西农业大学 生物科学与工程学院，江西 南昌330045;3.上海市农业生物基因中心，上海201106)

杂交水稻技术是我国自主创新并领先于世界的重大技术［1］，从1964 年起，我国就开始了水稻雄性不育系的研究。1966 年袁隆平发表的《水稻的雄性不育性》开创并指导了杂交水稻的研究和创新［2］。而在1970 年，发现了一株雄性不育野生稻，后被命名为“野败”。从1971 年开始，杂交水稻研究课题被列入全国协作项目。1972 年，袁隆平和其他育种工作者选育出了第一批野败型雄性不育系和保持系。到1985 年为止，在这十三年时间里，已经有200 多个来自“野败”质源的雄性不育系。在1987 年袁隆平发表的《杂交水稻育种的战略设想》为杂交水稻由三系经两系法到一系法、由品种间到亚中间再到远缘杂种优势利用的阶段性发展提供了蓝图［2］，成功地引导我国杂交水稻研究进入第二战略阶段并取得了突破性的进展;1997 年提出的“杂交水稻超高产育种”理论［2］。

种子纯度是衡量杂交水稻种子质量的主要指标，纯度的下降将导致作物产量和质量的明显降低［3］。低纯度、真实性差的杂交水稻种子给农业生产带来极大损失。特别是近年来市场经济的影响，假种子事件屡见不鲜，国家和农民的利益受到极大的损害，成为良种推广和全国水稻总产提高的一大潜在障碍［1］。

目前分子标记方法主要有限制性酶切片段多态性RFLP(restriction fragment length polymorphism)、随机扩增DNA 多态性RAPD(random amplified polymorphic DNA)、简单系列重复SSR(simple sequence repeats)和扩增片段长度多态性AFLP(amplified fragment length polymorphism)等［4－6］.

SSR 即简单序列重复(simple sequence repeat)，又叫微卫星DNA (microsatellite DNA)，也可称为简单序列长度多态性(simple sequence length polymorphism)［7］，是指基因组中由1 ～6 个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200 bp以下，相同座位上的重复序列由于重复次数的不同而产生了等位基因的多态性。SSR 标记由于具有数量丰富、多态性高、遗传上呈共显性、实验操作简单结果稳定可靠、引物序列易交流等多个优点，是一种理想的分子标记技术［8－10］。

杂交水稻种子不纯主要是制种使用的不育系中混杂有保持系或收获过程中混有恢复系。SSR 分子标记技术用于杂交水稻种子纯度鉴定，是基于F1种子具有父母本共同的遗传基础而父母本之间又在特定的SSR 位点存在多态性，通过筛选引物对样品DNA 进行PCR 扩增，凝胶电泳后在紫外光下观察经EB 染色的不同DNA 谱带类型，F1具有双亲互补的带型，很容易将杂交组合与其亲本分辨开来［9－10］。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验的材料来源于上海市农业生物基因中心2010 年度制种的21 个三系杂交旱稻组合及其亲本。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 提取 ①获取材料。浸种:从每个三系杂交组合中随机提取200 粒水稻种子，放于盒子中，编号，加入适当水，过夜。催芽:将浸种的水倒出，然后加入适当的自来水(水不要浸没种子表面)，然后放于28 ℃恒温箱中，及时进行观察，注意种子的干湿度。剪苗:种子露白之后，注意每天对其进行换水，待苗长到3 ～5 cm 时，取出将其剪到(尽量剪碎)PCR 板样孔中。②吐温法提取DNA。将剪好的材料装好，然后每样孔加入Buffer A(20%吐温20/10 mol/L NaOH 10∶1)50 μL，摇匀放于95 ℃水浴锅中加热10 min，取出加入Buffer B，加好后放于1 000 r/min 离心机上离心1 min 中，放于4 ℃冰箱保存待用(保存时间不宜过长)。

1.2.2 标记选取与分析 以均匀分布于12 条染色体的600 个SSR 标记对杂交水稻亲本进行多态性分析。引物由上海生物工程公司合成。

1.2.3 PCR 扩增和产物检测 PCR 扩增采用20 μL 反应体系，PCR 反应体系:10 ×PCR buffer 2.0 μL，2 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L forward primer 1 μL，10 μmol/L reverse primer 1 μL，25 ng/μL DNA 2 μL，Taq DNA 聚合酶1 U，加dd H2O 至总体积20 μL。

PCR 反应程序:94 ℃10 min，94 ℃1 min，55 ℃30 s，72 ℃45 s，35 cycles，72 ℃5 min，10 ℃贮存。

PCR 反应在PCR 热循环仪上进行。反应结束后加入5 μL 6 ×溴酚蓝上样缓冲液待检测。

琼脂糖电泳检测，取出已经加好溴酚蓝的DNA 样品(用PCR 板装)，10 μL 排枪(12 孔)，及marker标准样品，按样品DNA—marker—受体亲本—供体亲本顺序进行点样。盖上电泳槽盖，打开电源，将电压调制240 V，电泳1 h，读带并记录下基因型。

2 结果与分析

2.1 杂交水稻组合亲本多态性标记检测

选择分布于12 条染色体的600 对SSR 引物(RM1 －RM600)，在21 个三系杂交组合的17 个亲本材料进行多态性标记筛选分析。图1 是RM304、RM475、RM3 3 个引物标记在30 g/L 琼脂糖凝胶的电泳图。结果表明:RM304 标记在5A/旱恢3 号、5A/旱恢29 号、5A/旱恢31 号、新1A/旱恢3 号、7A/旱恢3号、7A/旱恢9 号、7A/旱恢31 号、11A/旱恢3 号、605A/旱恢3 号、5A/旱恢3 号、11A/旱恢31 号、11A/旱恢29 号、11A/旱恢33 号和603A/旱恢3 号等14 个组合的亲本之间有差异，可以进行纯度检测。RM475 标记在7A/旱恢21 号这个组合的亲本之间有差异，可以进行纯度检测。RM3 标记在5A/旱恢33、603A/旱恢11 号、3057/3058//旱恢3 号、623A/旱恢3 号、623A/旱恢33 号、603A/旱恢25 号和11A/旱恢11 号等7 个组合的亲本之间有差异，可以进行纯度检测。

图1 亲本多态性分析Fig.1 Analysis of parents polymorphism

图1 是标记在30 g/L 琼脂糖凝胶的电泳图，是3 对引物对17 个亲本进行的多态性检测图。本实验采用的标准样品是Marker D2000，点在每排梳子的中间孔道，它能分别跑出6 条带，从上而下分别表示DNA 分子量是2 000，1 000，750，500，250，100 bp。从图1 中可以知道通过PCR 扩增的DNA 分子量大小在100 ～250 bp，看两亲本之间是否有差异，主要是指在孔道上的位置是否能够明显的区分开来。通过亲本在泳道上的比对可以看出是能达到此目的的。

2.2 杂交组合纯度鉴定结果

根据亲本之间的SSR 标记检测结果，用RM304、RM475 和RM3 等3 个标记对22 个杂交组合的200个单株进行纯度检测。图2 是RM475 标记对7A/旱恢21 号这个组合的纯度检测结果。结果见表1，新1A/旱恢3 号和603A/旱恢25 号这两个组合的纯度是98.9%，纯度最好;11A/旱恢29 号的纯度是87.5%，纯度最差;其它杂交旱稻新组合纯度多在95%左右。

图2 是标记在30 g/L 琼脂糖凝胶的电泳图，是RM475 标记对7A/旱恢21 号这个组合的纯度检测结果(本图只取了其中的96 个样孔)。本实验采用的标准样品依然是Marker D2000，点在每排中间，两亲本点在每排的最后两个泳道，左边为受体亲本，右边为供体亲本。从图2 中可知，两亲本的DNA 分子量大小大概为250 bp，其差异显著，图2 中总共有两种带型，单带(14 个)或者是杂带(82 个)。所以计算杂交组合的纯度是用杂带数/总样品数。总实验结果见表1，各组合纯度均能很好的检测出。

表1 SSR 标记纯度检测结果Tab.1 The results of purity checking with SSR markers

3 讨论

(1)根据国家对杂交水稻种子纯度要求是96%，本次杂交组合纯度鉴定结果可知，本研究的21 组杂交组合中纯度大于96%的组合有5A/旱恢31 号、新1A/旱恢3 号、7A/旱恢9 号、7A/旱恢3 号、11A/旱恢3 号、605A/旱恢3 号、11A/旱恢31 号、603A/旱恢25 号8 个组合;5A/旱恢3 号、7A/旱恢31 号、11A/旱恢33 号、603A/旱恢3 号和3057/3058/旱恢3 号等5 个组合的纯度＞95%，基本上达到国家对杂交稻种子的纯度要求，制种过程中还有待进一步的注意。其他杂交组合中的种子纯度都不是很符合要求，特别是11A/旱恢29 号的组合中种子纯度只有87.5%，可能原因是所收获的种子除了混入有杂交稻的父本和母本材料外，很可能还混有其他杂交稻种子或是在授粉过程中，母本接受了其他花粉，导致亲本混杂形成其他杂合型材料。

图2 杂交组合(7A/旱恢21 号)纯度鉴定结果Fig.2 The result of purity identification to combination of hybrid upland rice (7A/hanhui 21)

(2)通过本试验对制种的杂交组合在其推广示范之前进行了纯度检测，确定了能推广示范的组合，淘汰了纯度不好的组合，避免了以后由于纯度不达要求所带来的不良影响，同时本方法的最大优点就是能够快速而准确的得出杂交组合纯度鉴定的结果。杂交水稻纯度鉴定的抽样群体大小，关乎到鉴定结果的准确性。纯度鉴定的样本群体越大，所得到的结果越准确。但是群体越大，工作量也越大。群体越小，结果随机性越大，没有代表性。目前，用SSR 标记进行纯度鉴定的实验大多选取100 粒种子进行纯度鉴定［3，8－13］。本试验每个杂交水稻组合随机选取了200 粒种子进行纯度鉴定。笔者对其中纯度较差的组合在海南进行了异地加代种植，田间小区种植鉴定结果与笔者实验室的检测结果相符。另外，笔者还对部分组合抽取了400 粒种子进行纯度鉴定，鉴定结果与抽取200 粒的鉴定结果完全相同。因此，笔者认为利用SSR 标记进行杂交水稻纯度鉴定的群体为200 株比较适宜，既保证了实验的准确性，又不增加太大工作量。

(3)杂交水稻种子纯度鉴定是基于父母本之间的遗传差异性的，由于不同SSR 标记的多态性检测能力差异大，通过筛选，可极大提高鉴别效率［14－16］。但由于笔者是以均匀分布于12 条染色体的600 个SSR 标记对杂交水稻亲本进行多态性分析。在进行引物筛选的过程当中，由于引物涉及种类较多，过程比较繁琐，工作量较大，如果能够筛选出专门针对某一种杂交组合的特异性更强的引物对杂交种进行鉴定，必将能够减少很多的工作量和试验成本，而且效果更好，可靠性更高。

［1］国家杂交水稻研究中心，湖南杂交水稻研究中心.中国杂交水稻(第一届中国杂交水稻大会论文集)［M］.长沙:湖南科技出版社，2010.

［2］袁隆平，辛业芸，符习勤，等.袁隆平论文集［M］.北京:科学出版社，2010.

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