HPLC法检测降血糖保健食品中的双胍类药物Δ

王俊苏，郗存显，陈冬东，张雷，李贤良，彭涛，王国民#（.重庆出入境检验检疫局/重庆市进出口食品安全工程技术研究中心，重庆 40000；.中国检验检疫科学研究院，北京 003）

双胍类药物用于糖尿病治疗始于20世纪50年代，其中二甲双胍是治疗2型糖尿病的一线药物，但过度服用会导致乳酸酸中毒，危及患者生命[1]；苯乙双胍也因其可致较高的乳酸酸中毒发生率，在欧美国家已停止使用，在我国也已趋于淘汰[2]。由于双胍类药物的降血糖效果较好，一些不法分子在降血糖保健食品中违禁添加了这类药物，而长期超量服用这些保健食品会严重危害患者的身体健康。为此，需要建立测定这类保健食品中双胍类药物的快速、可靠的方法。

目前，降血糖类保健食品中双胍类药物的测定方法主要有毛细管电泳法[3]、薄层色谱法[4-6]、高效液相色谱（HPLC）法[4-9]和液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）法[10-11]。其中，毛细管电泳法和薄层色谱法的选择性较差，检测结果容易受到其他因素的干扰；HPLC法具有快速、高分离度的优点，但多数方法未建立样品的净化方法[4-7]。由于保健食品成分复杂、基质干扰严重[12]，加之双胍类药物的极性强，在反相C18柱上保留时间较短，与杂质分离效果差，因此，采用HPLC测定时需要对样品进行净化，以提高方法的可靠性和灵敏度。

笔者采用超声法提取降血糖保健食品中的二甲双胍和苯乙双胍，将提取液经弱阳离子型WCX固相萃取柱净化后再进行HPLC测定，结果表明方法简单、可靠、灵敏。具体报道如下。

1 材料

1.1 仪器

1200型HPLC仪，配有二极管阵列检测器（DAD，美国Agilent公司）；Hei-VAP型旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）；3-30K型离心机（德国Sigma公司）；N-EVAP 116型氮吹仪（美国Organomation公司）；XH-B型旋涡混合器（江苏康健医疗用品有限公司）；AS20500BDT型超声波清洗器（天津市奥特赛恩斯仪器有限公司）；HH型恒温水浴锅（江苏金坛市中大仪器厂）。

LC-WCX固相萃取柱、HLB固相萃取柱、LC-18固相萃取柱（美国Supelco公司）；MCX固相萃取柱（美国Waters公司）。

1.2 药品与试剂

二甲双胍标准品（盐酸盐，批号：100664-200602，纯度：＞99%）、苯乙双胍标准品（盐酸盐，批号：100922-201001，纯度：＞99%）均由中国食品药品检定研究院提供；甲醇、乙腈、冰醋酸、庚烷磺酸钠均为色谱纯；无水乙醇、磷酸、磷酸氢二钾均为分析纯；试样基质（降糖粉，A公司，生产日期：20090805，规格：每袋1 kg；奶粉，B公司，生产日期：20100120，规格：每袋300 g；口服液，C公司，生产日期：20080919，规格：每瓶250 ml；胶囊，D公司，生产日期：20090806，规格：250 mg×10粒×4板；清渴茶，E公司，生产日期：20100102，规格：每盒150 g）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 标准贮备液。分别精确称取二甲双胍、苯乙双胍标准品10 mg（精确至0.01 mg），用适量甲醇溶解并定容至100 ml，混匀，制备成二甲双胍、苯乙双胍质量浓度均为100 mg/L的标准贮备液。

2.1.2 混合标准工作液。分别精密量取二甲双胍和苯乙双胍贮备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 ml，置于100 ml量瓶中，加甲醇稀释、定容，制备成二甲双胍、苯乙双胍质量浓度均为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L的混合标准工作液。

2.2 样品的提取与净化

2.2.1 提取。称取1.0 g（精确到0.01 g）试样于50 ml离心管中，加入10 ml甲醇-乙醇（50∶50，V/V），于旋涡混合器上混匀，超声10 min，7 000 r/min离心3 min，转移上层清液至100 ml旋蒸瓶中，再分别用10 ml甲醇-乙醇（50∶50，V/V）重复提取2次，合并上清液，旋蒸浓缩近干，用2 ml甲醇溶解残渣，再加入8 ml水，混匀，待净化。

2.2.2 净化。LC-WCX固相萃取柱使用前依次用3 ml甲醇和3 ml水活化。将待净化液全部转移至LC-WCX固相萃取柱中，用3 ml甲醇-水（50∶50，V/V）淋洗小柱，抽空，再用5 ml 3%乙酸甲醇溶液（取3 ml冰乙酸与97 ml甲醇混合即得）洗脱，收集洗脱液，于40℃下氮气吹干，残渣用1.0 ml流动相溶解，过0.22 μm滤膜后供HPLC测定。

2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为乙腈，流动相B为含庚烷磺酸钠-磷酸氢二钾的磷酸溶液（称取庚烷磺酸钠2.023 g、磷酸氢二钾2.282 g到500 ml量瓶中，再取1 ml用水溶解并定容，过0.45 μm滤膜，即得），流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：270 nm；进样量：10 µl；柱后平衡时间：3 min；梯度洗脱程序如表1所示。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab1 Gradient elution program of mobile phase

2.4 色谱专属性考察

取“2.1.2”项下二甲双胍和苯乙双胍质量浓度均为5.0 mg/L的混合标准工作液，进样测定，结果，二甲双胍和苯乙双胍的保留时间分别为8.5、17.9 min。称取试样清渴茶，按照“2.2”项下方法进行提取和净化后进样分析，记录色谱图；另取试样清渴茶样品，按5.0 mg/kg量添加二甲双胍和苯乙双胍后按照“2.2”项下方法进行提取、净化后进样分析，记录色谱图。结果表明，试样清渴茶经提取、净化后不存在干扰二甲双胍和苯乙双胍测定的物质。色谱见图1。

2.5 基质回收标准曲线制备

图1 高效液相色谱图A.混合标准工作液；B.试样；C.试样+混合标准工作液；1.二甲双胍；2.苯乙双胍Fig1 HPLC chromatogramsA.mixed standard substance；B.test sample；C.test sample+mixed standard substance；1.metformin；2.phenformin

分别准确称取试样1.0 g（精确至0.01g）于50 ml离心管中，分别加入“2.1.2”项下系列质量浓度的混合标准工作液1 ml，按“2.2”项下方法提取、净化，进样分析；以质量浓度（x，mg/L）为横坐标，以峰面积（y）为纵坐标绘制基质回收标准曲线。结果，二甲双胍和苯乙双胍的标准方程分别为y＝47.75x+0.21（r＝0.999 9）、y＝38.48x+1.33（r＝0.999 5），二者检测质量浓度线性范围均为0.1～5.0 mg/L。

2.6 定量限考察

分别称取1.0 g（精确到0.01 g）清渴茶试样共6份按0.1 mg/kg的量分别添加二甲双胍和苯乙双胍，并按照“2.2”项下方法进行提取、净化后进样分析，计算信噪比。结果表明，二甲双胍和苯乙双胍的信噪比均大于10，因此将二甲双胍和苯乙双胍的定量限定为0.1 μg/g。

2.7 回收率和精密度

文献[4-8]均报道了1～3种保健食品试样中双胍类药物的测定方法。本试验采用的试样基质有降糖粉、奶粉、口服液、胶囊、清渴茶5种保健食品，几乎涵盖了糖尿病患者服用的保健食品的所有种类，保障了试验数据的代表性和检测方法的适用性。采用上述基质，分别按照1.0、2.0、5.0 mg/kg 3个水平进行添加回收试验，每个浓度水平分析6次。结果，二甲双胍和苯乙双胍的平均回收率分别为91.9%～102.7%、89.8%～107.0%，RSD均小于9.46%，具体结果见表2。

2.8 试样分析

取5种试样，分别进行提取、净化后进样分析，结果，5种试样中均未检出二甲双胍和苯乙双胍。

3 分析与讨论

3.1 提取溶剂的选择

以清渴茶为基质，按1 mg/kg添加二甲双胍和苯乙双胍，考察不同溶剂（甲醇、乙醇、乙腈及混合溶剂）对双胍类药物的提取效率，结果见表3。

由表3可见，甲醇-乙醇（50∶50，V/V，含3%乙酸）及甲醇-乙醇（50∶50，V/V）对二甲双胍和苯乙双胍的提取效率较其他溶剂好。由于2种提取溶剂中二甲双胍的回收率都在80%以上，故根据苯乙双胍的回收率值的高低来选取提取溶剂。其中甲醇-乙醇（50∶50，V/V）作为提取溶剂时苯乙双胍的回收率相对较高，故最终以其为提取溶剂，并采用基质回收标准曲线进行定量，以弥补添加水平较低时前处理过程中双胍类药物的损失，可使回收率满足要求。

表2 二甲双胍和苯乙双胍的回收率结果（n＝6）Tab 2Recovery rates of metformin and phenformin（n＝6）

表3 不同提取溶剂对二甲双胍和苯乙双胍回收率的影响Tab3 Influence of different extraction solvent on recoveries of metformin and phenformin

3.2 提取方式的选择

前期试验比较了超声波提取、旋涡振荡提取和微波提取3种提取方式的提取效果。结果显示超声波和旋涡振荡均能提高提取效率，而微波提取对回收率没有明显的影响，因此选用先旋涡振荡后超声提取10 min的提取方式。

3.3 固相萃取柱和洗脱溶剂的选择

固相萃取是一种基于“相似相溶”原理进行分离和净化的技术[13]。前期试验中比较了LC-WCX、MCX、HLB、LC-18等固相萃取柱对样品的净化效果；同时，试验了甲醇、5%氨化甲醇（取5 ml氨水与95 ml甲醇混合即得）、3%乙酸甲醇作为洗脱溶剂的洗脱效率。结果表明，双胍类药物在HLB和LC-18柱上基本不保留；而由于双胍类药物与强阳离子型MCX柱中的阴离子作用力较强，采用MCX柱时3种洗脱溶剂均难以洗脱药物，只有采用文献[8]中较强的甲醇-0.4 mol/L氢氧化钠溶液（60∶40，V/V）才能有效地洗脱，故MCX柱不适合采用；采用作用力相对较弱的弱阳离子型LC-WCX柱净化时，以3%乙酸甲醇溶液作为洗脱溶剂，利用溶剂中的氢离子（H+）与LC-WCX柱上吸附的双胍类药物发生离子交换，使之解离而被有效地洗脱。因此，本试验最终采用LC-WCX柱，以5 ml、3%乙酸甲醇溶液作为洗脱溶剂用于样品的净化。

3.4 液相色谱柱的选择

反相C18色谱柱常用于双胍类药物的分离[4-9]。由于双胍类药物属于强极性含氮化合物，在反相色谱柱上保留较差，同时还容易产生二次保留作用，从而发生色谱峰拖尾现象[8]。在流动相中加入酸性缓冲盐[6-8]，或加入庚烷磺酸钠、十二烷基磺酸钠[4-5]等离子对试剂，能够抑制双胍类药物的电离，增强双胍类药物的保留和避免拖尾。前期曾试验用Shimadzu VP-ODS C18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）、Waters Xetrra MS C18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）、Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3种反相色谱柱进行试验，并在流动相中加入磷酸盐缓冲液和0.01 mol/L庚烷磺酸钠对双胍类药物进行分离。结果表明，Shimadzu VP-ODS C18、Waters Xetrra MS C18不能很好地保留二甲双胍，出峰时间较快，峰形不好；Agilent SB-C18对二甲双胍和苯乙双胍都能很好地保留，峰形较好，响应强度较高。因此本试验采用Agilent SB-C18色谱柱分离二甲双胍和苯乙双胍。

笔者建立了同时测定降血糖类保健食品中二甲双胍和苯乙双胍的HPLC方法。方法采用基质回收标准曲线定量，解决了添加浓度较低时回收率较低的问题；建立了弱阳离子型固相萃取柱净化方法，能有效去除杂质的干扰；研究了降糖粉、奶粉、口服液、胶囊、清渴茶5种基质中双胍类药物的回收率，保障了试验数据的代表性和检测方法的实用性。结果表明，建立的方法线性范围宽、精密度高、回收率较好，具有简单、可靠、灵敏等特点，可用于降血糖保健食品中双胍类药物的监测。

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