新型手性HPCE整体柱拆分氧氟沙星

沈静茹，蔡 薇，余学红，王 伟，张 祎

(1中南民族大学化学与材料科学学院，分析化学国家民委重点实验室;2中南民族大学校医院，武汉430074)

氧氟沙星是一种喹诺酮类广谱抗菌药，为DNA螺旋酶抑制剂，主要通过选择性抑制细菌DNA回旋酶的活性，阻碍细菌DNA的合成，达到杀菌的目的.药品氧氟沙星是其左旋和右旋异构体的消旋体化合物，其中左旋光学异构体的抗菌活性较右旋体强［1］.目前，在高效毛细管电泳(HPCE)中用 β-环糊精(CD)及其衍生物作为手性拆分氧氟沙星的主要方法是手性添加剂法.如Khaldun M.Al Azzam［2］采用硫酸基-β-CD手性添加剂法使氧氟沙星对映体得到基线分离，分离度Rs达5.45;马骞［3］等分别采用β-CD，HP-β-CD(羟丙基-β-CD)和 DM-β-CD(二甲基-β-环糊精)对氧氟沙星对映体进行了拆分，结果β-CD不能分离氧氟沙星，HP-β-CD分离效果较差且分析时间较长，DM-β-CD可使氧氟沙星达到基线分离.Li Yingjie［4］用 Asp-β-CD、NH2-β-CD、HP-β-CD以聚合物手性整体形式聚合到以甲基丙烯酸缩水甘油酯及乙烯二甲基丙烯酸酯为单体制备的整体柱上，成功实现了几种外消旋体中对映异构体的分离及几种常见氨基酸的分离;Tian Yun［5］用新型的β-CD衍生物HPCE整体柱成功分离了布洛芬和萘普生;Koide Takashi［6］用手性冠醚键合的整体柱分离了主要的氨基化合物对映体.

本文首次采用新型β-CD衍生物手性HPCE整体柱，即选用双-(6-氧-间羧基苯磺酰基)β-CD(简称β-CD-M1)，将其作为固定相中单体制备HPCE整体柱，在高效毛细管电泳仪上分离手性药物氧氟沙星对映体，分离度Rs可达7.72，与文献［2］中硫酸基-β-CD衍生物比多了苯环的π-电子的影响和间位羧基的作用，构建的手性环境与氧氟沙星对映异构体之间的相互作用位点相对较丰富，故而达到更优分离效果，为分离氧氟沙星对映异构体提供了新的手性HPCE整体柱拆分方法.

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

高效毛细管电泳仪(CL1020型，北京彩陆科学仪器有限公司，中国科学院研究生院应用化学所)，酸度计(pHS-3C型，上海伟业仪器仪表厂)，融硅石英毛细管(75 μm，有效长度55 cm，河北永年光纤厂)，0.22 μm微孔滤膜(上海市新亚净化仪器厂).

三羟甲基氨基甲烷(Tris，上海山浦化工有限公司)，磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)，盐酸(信阳市化学试剂厂)，氧氟沙星片(广州白云山制药有限公司)氧氟沙星对照品(含量98.8%，中国药品生物制品检定所)、超纯水(美国 Moleculer超纯水机)，双-(6-氧-间羧基苯磺酰基)-β-环糊精［7］自行合成，其他试剂均为分析纯.

1.2 药品前处理

将氧氟沙星片溶于水中，用超纯水稀释，配置成不同浓度，氧氟沙星对照品，用超纯水配置成10－9g/L，Tris-H3PO4缓冲液按实验需要配置成不同浓度和pH.所有溶液均经0.22 μm的微孔滤膜过滤.

1.3 HPCE整体柱分析前处理

HPCE手性整体柱在每次运行之前用Tris-H3PO4缓冲液冲洗1 h，采用注射器压力进样20 s，分离电压为25 kV，检测波长为254 nm，温度20℃.

2 结果与讨论

2.1 缓冲液pH值对分离的影响

在β-CD-M1衍生物HPCE整体柱上，检测波长254 nm，工作电压25 kV，10－8g/L氧氟沙星进样20 s，20℃的电泳条件下，固定 Tris-磷酸总浓度为50mmol/L，通过改变溶液中磷酸的量来改变溶液的pH 值，使之分别为 3.5、3.7、4.0、4.5、5.0、5.5，分离结果见图1.如图1所示，氧氟沙星对映体的分离度均大于7，表明缓冲液pH在上述范围内变化对分离度的影响较小，在此酸度范围内整体柱内pH对电渗流的影响变小，缓冲液pH为5.0时氧氟沙星对映体虽可分离(Rs=7.47)，但基线不稳;pH大于5.0时，氧氟沙星的洗脱强度减弱;缓冲液pH在3.5～5.0时，氧氟沙星对映体均达到基线分离;缓冲液pH 小于 3.5(pH 2.8～3.4)时，毛细管整体柱柔韧性变弱，易断;pH为4.0时分离度最大且峰对称性、洗脱强度、基线均较理想:故选择缓冲液为pH 4.0.

图1 不同pH对氧氟沙星对映体分离度的影响Fig.1 Effect of different pH buffer on the separation of ofloxacin

2.2 缓冲液浓度对分离的影响

在β-CD-M1衍生物HPCE整体柱上，检测波长254 nm，工作电压25 kV，进样10－8g/L氧氟沙星20 s，Tris-磷酸缓冲液 pH 4.0，20℃ 的电泳条件下，改变缓冲液 Tris-磷酸的浓度分别为10，20，30，40，50，60，70，80 mmol/L，结果见表 1.如表1 所示，缓冲液浓度为10 mmol/L或80 mmol/L均未有物质洗出，在20～70 mmol/L范围内，氧氟沙星两对映体均可达到基线分离.缓冲液浓度较低，基线出现漂移，且有杂峰出现;缓冲液浓度较高时，基线同样出现漂移和杂峰，且缓冲液对氧氟沙星的洗脱强度较小;缓冲液浓度为50 mmol/L时，峰形较为对称，基线平稳，缓冲液对氧氟沙星的洗脱强度较大:故选择缓冲液浓度为50 mmol/L为最适浓度.

表1 不同缓冲液浓度对氧氟沙星对映体分离的影响Tab.1 Effect of different buffer concentrations on the separation of ofloxacin enantioseparation

2.3 不同电压对分离的影响

在β-CD-M1衍生物HPCE整体柱上，检测波长254 nm，进样 10－8g/L 氧氟沙星 20 s，Tris-磷酸缓冲液 50 mmol/L，pH 4.0，20℃的电泳条件下，分别考察5，10，15，20，25，28 kV 时，氧氟沙星对映体的分离状况，结果见图2.如图2所示，改变分离电压对电迁移和电渗流有一定的影响，增加电压有利于加快分离速度.随着电压的逐渐增大保留时间逐渐减小，当电压达到28 kV时两峰重叠，无法分离;而电压为25kV时峰形对称，两峰响应相当，且洗脱强度均较大，总的分离分析时间最短，达到基线分离:故选择电压为25 kV为最适电压.

图2 不同电压下的氧氟沙星对映体分离图Fig.2 Effect of voltages on the separation of ofloxacin enantioseparation

2.4 方法评价

2.4.1 对照品线性范围

配置氧氟沙星对照品溶液，浓度分别为:2×10－9，3 ×10－9，4 ×10－9，5 ×10－9，6 ×10－9g/L，在β-CD-M1为单体制备的手性HPCE整体柱上，分离电压 25 kV，Tris-H3PO450 mmol/L，pH 4.0，检测波长254 nm，进样20 s的条件下，考察了氧氟沙星标准品的线性范围，氧氟沙星前峰峰高与浓度线性方程为 y=26598.78+4.817 × 10－13x，r=0.9804，前峰峰面积与浓度线性方程为y=202662.36+3.746×10－14x，r=0.9779;后峰峰高与浓度的线性方程为y=36914.14+4.652 ×10－13x，r=0.9614，后峰峰面积与浓度的线性方程为 y=139120+3.48092×10－14x，r=0.9872.

2.4.2 精密度测定

将浓度为2×10－9g/L的氧氟沙星对照品，在最佳分离条件下，重复进样7次测定两组份的保留时间tR、峰高h、峰面积A，结果见表2.由表2可知，前峰各电泳参数的RSD为5.37%～12.54%，而后峰的各参数RSD为4.22%～5.18%，说明后峰各参数重现性优于前峰.

表2 氧氟沙星对照品精密度测定结果(n=7)Tab.2 Results of ofloxacin eniramine standard precision determination(n=7)

2.4.3 对比实验

在50mmol/L Tris-H3PO4缓冲液，pH 值为4.0，进样量为10－9g/L，进样时间20s的氧氟沙星标准品，20℃的电泳条件下，在 β-CD-M1衍生物 HPCE整体柱和空管柱中拆分氧氟沙星对映体，结果如图3所示.由图3可见，手性HPCE整体柱能够将氧氟沙星基线分离(图3a)，洗脱强度比较大，分离时间比较短，并且分离度达到7.72，空的毛细管柱不能将其分离(图3b).

图3 氧氟沙星对映体在不同毛细管柱下的分离Fig.3 Separation of Ofloxacin with different columns

3 结语

以双-(6-氧-间羧基苯磺酰基)-β-CD手性HPCE整体柱拆分了手性药物氧氟沙星，并研究了缓冲液的浓度、酸度、分离电压对分离情况的影响，建立了新的高效毛细管电泳手性整体柱拆分氧氟沙星的方法.在pH 4.0，浓度为50 mmol/L的Tris-磷酸缓冲液中进样时间20 s，工作电压25 kV，检测波长254 nm条件下，氧氟沙星对映体得到基线分离，分离度达到7.72.氧氟沙星对照品浓度在(2～6)×10－9g/L范围内，峰高、峰面积与浓度成线性关系，相关系数r最高可达0.9872.经7次相同条件的精密度实验确定，前峰相应信号重现性低于后峰，后峰峰高、峰面积的RSD分别为5.18%和4.40%.

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