寒凝证类痛经大鼠模型血液流变学实验观察

申松希,张 玲,朱世鹏,任晓暄,郭孟玮,赵雅芳,李晓泓,嵇 波,张露芬,朱 江

(北京中医药大学针灸推拿学院,北京100029)

原发性痛经(primary dysmenorrheal,PD)是妇科最常见的症状之一,是指行经前后或月经期出现下腹疼痛、坠胀,伴腰酸或其他不适,疼痛程度严重时影响生活和工作质量。寒凝血瘀是痛经的主要病机之一,由于寒冷刺激而引起的机体内血液凝滞,血脉不通,血不归经,瘀滞不行,瘀积不散,血泣则不通等病理变化。虽然目前痛经的动物模型制作已经成熟,但是基于中医学“病证结合”的“寒凝型痛经”模型制作目前报道尚少。因此本实验拟采用全身冷冻法观察对大鼠机体产生的影响,并观察寒冷刺激后血液流变学的变化,以评价全身低温冷冻方法制备寒凝证类痛经动物模型的适宜时间。

1 实验材料

1.1 动物 本动物实验过程均遵守美国国立卫生院倡导的实验动物关怀和使用指导原则和以减少(Reduction)、替代(Replacement)和优化(Refinement)为核心的动物实验“3R”原则。采用清洁级健康Sprague-Dawley(SD)品系雌性大鼠,3月龄,性成熟未交配,体质量(240±20)g,购自军事医学科学院,合格证号:SCXK(军)2007-004。饲养条件:室内温度(20±1)℃,湿度(45±5)%,日光灯光照,普通清洁级鼠饲料,自由饮用自来水。

1.2 仪器与试剂 仪器:BT223 S电子天平,北京赛多利斯仪器系统有限公司;电热恒温水浴箱,北京市医疗设备厂;MDF-u50A型超低温冷柜,日本三洋公司TX51;显微镜,日本Olympus公司。试剂:苯甲酸雌二醇注射液,上海通用药业股份有限公司生产,批号:040304;缩宫素注射液,上海禾丰制药厂生产,批号:070709;氨基甲酸乙酯,北京笃信精细制剂厂,批号:0081103。

2 实验方法

2.1 分组 将实验大鼠编号、标记、称重,通过阴道涂片法随机分为4组。每日定时将3月龄SD雌性大鼠用细棉签以生理盐水湿润后轻轻插入大鼠阴道约0.5 cm,慢慢转动一下取出,将带有阴道内含物的细棉签在载玻片上均匀转动涂片,在空气中干燥,然后在显微镜下观察阴道涂片的组织学变化。根据细胞形态、种类及数量筛选处于动情间期的3月龄SD雌性大鼠39只,按照随机数字法分为4组,分别为:空白对照组10只,类痛经模型组10只,冷冻5 d加给药组10只,冷冻10 d加给药组织。

2.2 模型制备 空白对照组为室温(20±1)℃,动物房内饲养,同步抓取不做任何处理。类痛经模型组,依据《药理实验方法学》[1]并加以改进。类痛经模型组,每日给予大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇注射液,连续10 d,第1天及第10天每日注射0.5 mg/只,第2～9天每日0.2 mg/只,末次给药1 h后,腹腔注射缩宫素2 u/只。寒凝证类痛经模型组,采用寒凝证模型结合类痛经模型的造模方法。冷冻5 d加给药组,给予皮下注射苯甲酸雌二醇连续10 d,第1天及第10天日注射0.5 mg/只,第2～9天每日0.2 mg/只,末次给药1 h后,腹腔注射缩宫素2 u/只。每天在注射以后,大鼠放入低温冷柜(-25℃)冷冻,持续受冻4 h左右,中间间隔2 h开盖通气5 s,连续冻5 d;冷冻10 d加给药组,每日在给药后大鼠放入低温冷柜,在-25℃的冷环境中持续受冻4 h左右,中间间隔2 h开盖通气5 s,连续冻10 d。

2.3 血液流变学检测 所有大鼠处理后均上午取材。肌注20%氨基甲酸乙酯(0.7 mL/100 g)麻醉大鼠,剖开大鼠腹腔,暴露腹主动脉,取出血液5 mL,置于肝素抗凝管内。送环宇金科生物医学技术(北京)有限公司,血液流变学指标检测采用MVIS-2040全自动血液流变仪。

3 实验结果

3.1 寒凝证模型大鼠全血黏度的变化 与对照组比较,冷冻5 d加给药组的全血黏度低切和高切有所升高,经统计学处理无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 全血黏度的变化(±s) mpa·s

表1 全血黏度的变化(±s) mpa·s

组 别 n 全血黏度低切全血黏度中切全血黏度高切空白对照组 10 27.87±2.1017.94±0.76 13.77±1.45类痛经组 10 27.59±1.9417.47±0.31 13.78±0.71冷冻5 d加给药组 10 28.02±2.8917.50±0.65 13.80±0.56冷冻10 d加给药组 9 27.56±2.5917.01±1.08 12.79±1.08

3.2 寒凝证模型大鼠全血还原黏度的变化 见表2。

表2 全血还原黏度的变化(±s) mpa·s

表2 全血还原黏度的变化(±s) mpa·s

注:与对照组比较,#P<0.05。

组 别 n 全血黏度低切全血黏度中切全血黏度高切空白对照组 10 48.62±2.8030.98±2.19 21.10±1.84类痛经组 10 47.76±2.9531.01±1.94 23.35±1.63#冷冻5 d加给药组 10 48.79±4.7532.25±2.82 24.10±2.51#冷冻10 d加给药组 9 48.75±3.5429.63±3.27 21.05±2.47

3.3 寒凝证模型大鼠红细胞压积、聚集指数、电泳,刚性指数的变化 见表3。

表3 红细胞压积、聚集指数、电泳,刚性指数的变化(±s)

表3 红细胞压积、聚集指数、电泳,刚性指数的变化(±s)

注:与对照组比较,#P<0.05。

组 别 n 红细胞压积红细胞聚集指数红细胞电泳刚性指数空白对照组 1053.90±3.14 2.07±0.323.87±0.45 12.15±1.86类痛经组 1052.70±1.49 2.67±0.734.39±0.95 12.82±1.08冷冻5 d加给药组 1051.80±2.30 2.82±1.094.95±1.7213.90±1.36#冷冻10 d加给药组 9 52.33±2.45 2.24±0.304.38±0.7812.17±1.46

4 讨论

原发性痛经(PD)属中医学中“经行腹痛”范畴,与胞宫、肝、肾、脾、冲任督脉关系密切,主要病机为气血运行不畅,冲任失调,而导致“不通则痛”和“不荣则痛”。寒湿凝滞证是临床常见的证型之一,因经期冒雨、涉水、游泳或经期贪食生冷,内伤于寒,或生活于湿地,风冷寒湿客于冲任、胞中,以致经血凝滞不畅。寒凝与全身或局部的血液循环障碍有关,中医认为血“得温则行,逢寒则凝”。寒则凝,凝则成瘀,故寒邪易致寒凝血瘀。根据这一理论,本课题探索了寒凝证模型的制备方法。

资料[2-3]证明,寒凝证一般都伴有血液流变学异常,血液流变学异常时可出现血瘀证,产生血瘀证是由于血流成分与性状改变,而致黏、浓、聚、凝。“黏”是指全血黏度、血浆黏度增加;“浓”是指红细胞压积、三酰甘油、胆固醇、球蛋白、脂蛋白增加;“凝”则指血液凝固性增加,纤维蛋白原含量增加,纤溶活性降低,血浆复钙时间缩短;“聚”是指红细胞及血小板在血浆中电泳速度减慢,血小板对ADP类诱导物质的聚集性增加。其形成机理是由于寒冷的侵袭而使交感神经兴奋,引起血管壁损伤,使血管通透性增加,而丢失较小的蛋白分子。此外,由于持续的寒冷刺激,引起血管平滑肌收缩及血管壁损伤,使血栓素增加,血小板聚集功能亢进,机体全身血液流变性和凝血机制失调,成为浓、黏、聚状态。

据文献记载,寒凝模型造模方法主要有局部冻伤法、全身冷冻法、风寒环境法、冰水浸泡法、冰水浸泡加药物法、冷刺激法、寒凉中药法等方法[4-6]。本实验在查阅大量文献基础上采用并改良全身冷冻方法和注射苯甲酸雌二醇、缩宫素结合的方法造成寒凝证类痛经大鼠模型,冰冻温度为-25℃,时间为4 h,中间间隔2 h开盖通气5 s,以保证大鼠有充足的氧气,连续冷冻5、10 d。此时大鼠出现畏寒喜暖,蜷缩少动,朦胧欲睡,反应迟钝,呼吸微弱,皮毛蓬松竖立,小便色淡,大便溏,耳色暗红,爪尾部紫暗肿胀、甚则尾部皮肤破烂等症状。寒凝类痛经模型组大鼠除引起上述局部紫绀、肿胀、瘀血外,亦可引起全身反应主要是血液流变学相关指标异常,全血黏度、全血还原黏度升高,刚性指数、红细胞聚集指数、红细胞电泳均有不同程度增加等说明确有“寒凝血瘀”之症。本实验所取的全身冷冻方法是将模拟的病因病机、症状及血液流变学检查融为一体建立的动物模型。模拟病因病机:根据中医病因病机采用冷冻致寒凝,寒为阴邪、寒入于经,经脉拘急,血得寒则凝,可致血液凝滞,运行不畅而成寒凝血瘀,血液凝涩而不能畅通;模拟症状:大鼠出现畏寒蜷缩弓背,精神萎靡,反应迟钝,行动缓慢 ,毛松竖起脱落 ,耳 、尾、爪 、舌紫暗 ,体温下降 ;血液流变学:寒凝模型组的全血还原黏度和刚性指数明显升高,与对照组比较差异显著。结果显示,寒凝证类痛经大鼠模型,与对照组比较,血流指标均有升高趋势,证明寒凝证类痛经的制备方法稳定可靠。

综上所述,本实验采用模拟病因、症状表现、实验指标等方面综合评价方法证明了寒凝证结合类痛经的制备方法可行,模型制备简便实用,符合中医证候特点,也与现代医学的观点相一致。

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[5]周华妙,郭勇.寒凝血瘀证小鼠动物模型的建立及评价[J].中国中医药科技,2010,17(1):1-2,7.

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