黄芪多糖通过TLR4/NF-κB信号通路抑制脂多糖诱导的大鼠心肌细胞肥大

孙雪芳，王洪新，梁灵君，鲁美丽，顾洁莹，何海洋

(辽宁医学院心脑血管药物重点实验室，辽宁锦州 121001)

黄芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)是中药黄芪的主要活性成分之一，可以提高心肌细胞存活率，抑制细胞凋亡，对缺氧/复氧损伤心肌细胞有保护作用［1］。脂多糖(lipopolysaccharide ，LPS)，是革兰阴性菌的主要致病成分，可诱导病理性心肌肥厚，表现为心肌细胞体积增大，肌动蛋白丝重组等［2］。LPS诱导的炎症反应主要由 TLR4受体介导，当TLR4被激活时，与分子伴侣热休克蛋白60结合，激活核因子-κB(nuclear factor-κB ，NF-κB)，诱导单核/巨噬细胞产生免疫炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)等，引起心肌细胞肥大，心肌收缩力异常及心肌细胞的凋亡［3］。有研究显示，APS对LPS诱导的大鼠腹腔巨噬细胞产生的TNF-α、IL-1有不同程度的抑制作用，提示其可通过抑制炎症因子的分泌，减少组织细胞的损伤发挥其对机体的保护作用［4］。本实验室前期研究发现，黄芪多糖在抑制LPS诱导心肌细胞肥大的同时，可降低TNF-α的表达量［5］，但是否是通过 TLR4-NF-κB 通路降低 TNF-α的量，从而对LPS诱导的心肌肥大产生保护作用，尚未进行深入探讨。因此本实验用LPS诱导SD乳鼠心肌细胞肥大，旨在从TLR4/NF-κB信号途径入手观察APS对LPS诱导心肌肥大的保护作用及具体机制。

1 材料

1.1 动物 出生2～3 d的SD大鼠乳鼠，♀♂不拘，由辽宁医学院实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK(辽)2003-0007。

1.2 药品与试剂 黄芪多糖，陕西森弗生物技术有限公司，批号:HQ090312，纯度98%;LPS，Sigma公司;DMEM培养基，Gibco公司;胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司;IκBα抑制剂BAY11-7082江苏碧云天生物工程公司;TNF-α ELISA检测试剂盒，研域(上海)化学试剂有限公司;IκBα一抗，北京博奥森生物技术有限公司;RT-PCR试剂盒，大连宝生物工程有限公司。

1.3 仪器设备 超净工作台，江苏吴县市净化技术研究所;CO2孵箱，美国Sheldon Manufacturing Inc公司;79-1磁力加热搅拌器，江苏金坛中大仪器厂;TDL-4型离心机，上海安亭科学仪器厂;DNM-9602G酶标分析仪，北京普朗新技术有限公司;倒置相差显微镜，德国Leica公司。

2 方法

2.1 乳鼠心肌细胞原代培养 乳鼠无菌条件下开胸取出心脏，D-Hanks液清洗血液，修剪除去相连血管及组织，保留心尖部分，眼科剪将其剪成0.5～1 mm3大小的组织块，用0.08%的胰酶37℃恒温消化10 min，吸取上清液弃去，再加入0.08%胰酶37℃恒温消化4～5次，每次约8 min，收集消化所得细胞，过筛网得到的单个细胞置于含15%小牛血清的低糖DMEM培养液中，装入培养瓶在5%CO2、37℃孵育箱中培养1.5～2 h，差速贴壁法得到心肌细胞，接种于培养瓶于孵育箱中继续培养。

2.2 分组及给药 常规培养心肌细胞48 h后，将心肌细胞分为7组，分别为:①对照组，不作任何处理;②模型组，用LPS 1 mg·L－1作用于乳鼠心肌细胞;③ LPS+BAY11-7082 组，用 5 μmol· L－1的BAY11-7082孵育心肌细胞30 min后加入1 mg·L－1LPS;④LPS+APS 25 mg·L－1组，用黄芪多糖25 mg·L－1孵育乳鼠心肌细胞30 min后，再加入1 mg·L－1的 LPS;⑤LPS+APS 50 mg·L－1组，用黄芪多糖50 mg·L－1孵育乳鼠心肌细胞30 min后，再加入1 mg·L－1的 LPS;⑥LPS+APS 100 mg·L－1组，用黄芪多糖100 mg·L－1孵育乳鼠心肌细胞30 min后，再加入 1 mg·L－1的 LPS;⑦BAY11-7082单用组，BAY11-7082孵育心肌细胞30 min后不作任何处理继续培养。

2.3 心肌细胞体积测定 将心肌细胞经“2.2”项方法分组和处理，继续培养48 h后取出，弃去各孔培养液，PBS快速冲洗3～4次后加0.1%胰酶在培养箱中孵育10 min后取出，随即马上加入含0.1%血清的DMEM终止消化。将合并收集的细胞注入一细胞室内(该细胞室底部是一经硅化的盖玻片，防止心肌细胞贴壁)，在×400倒置显微镜下观察细胞，几乎均呈球形。用计算机CIAS大恒细胞图像分析系统测量单个细胞的直径，进而计算出细胞的体积。每孔随机选择4个视野，每个视野测20个细胞。

2.4 心肌细胞蛋白含量测定 将心肌细胞经“2.2”项方法分组和处理，继续培养48 h后取出，弃去各孔培养液，D-hanks液冲洗3～4次后加入细胞裂解液SDS使细胞裂解，采用Bradford法测定每组细胞的总蛋白含量。

2.5 心肌细胞TLR4 mRNA表达测定 将心肌细胞接种于培养瓶中，经“2.2”项方法分组处理后，继续培养48 h，弃去培养液，PBS冲洗，收集各组细胞，加入TRIzol试剂完全裂解细胞，将细胞裂解液收集起来以氯仿进行抽提，用异丙醇沉淀，回收总RNA于－80℃贮存备用。1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计(A260/A280)鉴定RNA浓度和纯度。取约1 μg进行反转录。反转录条件为:42℃、60 min，99℃、2 min，4℃保存。TLR4的引物序列(5'-3')为:up:CTATCATCAGTGTATCGGTG，down:CAGTCCTCATTCTGGCTC(186bp);内参GAPDH的引物序列(5'-3')为:up:AATGCATCCTGCCACCACCAACTGC，down:GGAGGCCATGTAGGCCATGAGGTC(550 bp)。PCR反应条件为:94℃ 45 s，55℃ 50 s，72℃ 1 min 15 s。循环扩增结束后，取10μl反应产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳，接收后将凝胶置于凝胶成像系统进行观察和分析。

2.6 心肌细胞TNF-α测定 将心肌细胞按“2.2”项方法和处理后，继续培养6 h，收集细胞上清液，在无菌操作条件下按照ELISA试剂盒说明书测定细胞上清液中TNF-α的量，此项指标可反映出心肌细胞TNF-α的蛋白表达水平。

2.7 心肌细胞IκBα蛋白测定 将经“2.2”项方法分组和处理的心肌细胞在培养48 h后取出，收集各组细胞，提取各组心肌细胞总蛋白，采用考马斯亮蓝法定量。灌胶上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察Marker移动情况，根据所需适时终止电泳。取出电泳凝胶进行转膜，然后将得到的PVDF膜浸入封闭液置于摇床上缓慢摇1 h以上。用洗膜液略洗一下PVDF膜，切割后分别置于已按说明书稀释过的IκBα一抗溶液中，4℃杂交过夜。d 2取出用TBST冲洗3次，然后将PVDF膜放入二抗中摇床杂交1 h，取出洗膜，进行ELC反应上机检测。

2.8 数据处理 统计数据以SPSS 13.0软件进行分析，数据均以±s表示，采用单因数方差分析及LSD法。

3 结果

3.1 APS对心肌细胞体积和蛋白含量的影响 从Tab 1可以看出，LPS模型组同正常对照组比较，心肌细胞体积增大了46.7%，蛋白含量增加了66.0%;同 LPS模型组相比较，LPS+BAY11-7082组的心肌细胞体积减小了33%，蛋白含量降低了28.3%;APS低中高剂量组同LPS模型组相比，心肌细胞体积分别减小了15%、25.6%、34.3%，蛋白含量分别降低了13.4%、23.7%、29.7%，表明APS和BAY11-7082均对心肌细胞肥大有明显的抑制作用，且APS存在剂量依赖性;而BAY11-7082单用组同正常对照组相比心肌细胞体积和蛋白含量并无明显变化，表明IκBα阻断剂对正常心肌细胞的体积和蛋白含量并无明显影响。

Tab 1 Effects of different treatment on protein content and cell size of cultured ventricular myocytes of neonatal rats

3.2 APS对心肌细胞TLR4 mRNA表达的影响Fig 1和Tab 2的结果显示，同空白对照组比较，LPS模型组TLR4 mRNA表达增加了61.2%;与模型组比较，LPS+BAY11-7082组和APS中高剂量组中TLR4 mRNA表达明显降低(P＜0.01)，表明APS可能是通过抑制TLR4 mRNA的表达从而对LPS诱导的心肌细胞肥大起到保护作用。

Fig 1 Expression of TLR4 mRNA in cardiac myocytes of cultured neonatal rats

Tab 2 Effects of different treatment on TLR4 mRNA expression in cultured myocardial cells of neonatal rats(±s，n=6)

Tab 2 Effects of different treatment on TLR4 mRNA expression in cultured myocardial cells of neonatal rats(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs normal;#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS

Group TLR4 mRNA(IA TLR4∶IA GAPDH)Normal 0.231 ±0.002 LPS(1 mg·L－1) 0.698 ±0.019＊＊LPS+BAY11(5 μmol·L －1) 0.355 ±0.031##LPS+APS 25 mg·L －1 0.579 ±0.025#LPS+APS 50 mg·L －1 0.467 ±0.018##LPS+APS 100 mg·L －1 0.314 ±0.027##BAY11-7082(5 μmol·L －1)0.297 ±0.009

3.3 APS对心肌细胞IκBα蛋白表达的影响 Fig 2和Tab 3的结果显示，同正常对照组比较，LPS模型组IκBα蛋白表达降低了45.8%;LPS+BAY11-7082组和APS中高剂量组同模型组相比，IκBα蛋白表达明显回升(P＜0.01)，表明APS可能是通过抑制IκBα降解进而抑制NF-κB信号通路的激活达到对心肌细胞的保护作用;而BAY11-7082单用组的IκBα蛋白表达并无明显变化。

Fig 2 Expression of IκBα in cultured neonatal rat cardiac myocytes

3.4 APS对心肌细胞TNF-α的影响 从Tab 5中可看出，同正常对照组比较，LPS模型组的TNF-α含量明显增加(P＜0.01);而同模型组相比，LPS+BAY11-7082组和APS低中高剂量组TNF-α含量明显减少，差异有显著性(P＜0.01);BAY11-7082单用组中TNF-α含量并无明显改变。

Tab 3 Effects of different treatment on IκBα expression in cultured ventricular myocytes of neonatal rats( ± s，n=6)

Tab 3 Effects of different treatment on IκBα expression in cultured ventricular myocytes of neonatal rats( ± s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs normal group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS

Group A IκBα ∶A β-actin Normal 0.59 ±0.05 LPS(1 mg·L－1) 0.32 ±0.03＊＊LPS+BAY11(5 μmol·L －1) 0.51 ± 0.04##LPS+APS 25 mg·L －1 0.45 ±0.04#LPS+APS 50 mg·L －1 0.49 ±0.02##LPS+APS 100 mg·L －1 0.54 ±0.07##BAY11-7082(5 μmol·L －1)0.56 ±0.03

Tab 4 Effects of different treatment on TNF-α expression in cultured ventricular myocytes of neonatal rats(±s，n=6)

Tab 4 Effects of different treatment on TNF-α expression in cultured ventricular myocytes of neonatal rats(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs normal;#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS

Group TNF-α/ng·L －1 Normal 19.2 ±5.1 LPS 1 mg·L－1 77.4 ±4.5＊＊LPS+BAY11(5 μmol·L －1) 39.5 ±6.1##LPS+APS 25 mg·L －1 32.4 ±4.2##LPS+APS 50 mg·L －1 27.1 ±2.8##LPS+APS 100 mg·L －1 22.3 ±3.9##BAY11-7082(5 μmol·L －1)20.5 ±2.7

4 讨论

心肌肥厚是由多种神经体液调节，体内多种细胞信号传导途径及基因参与调节的病理生理过程，是心脏对应激反应的一种代偿机制。众多研究表明，心肌肥厚是心衰的前期病变，是心衰、脑卒中、冠心病、猝死等的独立危险因素［6］。近年来，许多研究表明炎症因子的释放对心肌肥厚有着重要的影响，尤其是TNF-α，可能在心脏损害过程中起了重要的作用［7］，在高血压心脏病、冠心病和心力衰竭患者血清中均检测到了升高的TNF-α。已有临床研究表明，在高血压伴左心室肥厚组的TNF-α含量明显高于无心肌肥厚组，且与心肌肥厚指数呈正相关，这提示TNF-α在高血压左心室肥厚的病理过程中起重要作用［8］。TNF-α可增加肌动蛋白和肌球蛋白重链的合成，造成心肌肥大。同时，它还可以与其它致心肌细胞肥大的因子如IL-1β、IL-6等共同作用，引起心肌细胞肥大，诱导心肌细胞发生凋亡［9－10］。因此，通过抑制心肌炎症反应，降低炎症因子的释放，对心肌肥厚的研究和治疗具有重要的意义。

TLR4受体是介导炎症反应的跨膜受体，研究表明TLR4介导的信号通路在心衰、动脉粥样硬化、心肌重构等心血管系统疾病的发生发展中起着重要的作用［11－12］。实验发现，TLR4是介导 LPS信号转导的门户蛋白［13］。LPS是革兰阴性菌细胞壁外膜的主要成分，其诱导的炎症反应主要由TLR4来传导。当TLR4与相应配体结合，进一步激活NF-κB，从而促进各种炎性细胞因子基因表达的激活［14］。Purcell等［15］的研究表明，NF-κB 是大鼠心肌细胞培养中心室肌细胞肥大生长所必需的，其本身过度表达可以诱导心肌细胞的肥大。在静息细胞，IκBα蛋白通过其自身具有的一个特征性锚定蛋白与NF-κB二聚体结合在一起掩盖NF-κB核定位信号，从而抑制NF-κB的活性，在接受外来刺激后，IκBα蛋白降解，与NF-κB解离，使 NF-κB活化，作用于靶基因，诱导基因表达，其结果就是大量促炎细胞因子如TNF-α过度表达，最终造成一系列炎症反应及病症。

本实验中，LPS模型组的心肌细胞体积增加46.7%，蛋白含量增加66.0%，表明模型成功。在模型组中，心肌细胞 TLR4 mRNA表达增高，IκBα蛋白表达降低，TNF-α含量明显增加，表明 LPS可能是通过TLR4受体使NF-κB活化，并促进炎症因子的分泌，最终造成心肌细胞肥大。实验中发现，APS处理组中，肥大心肌细胞的体积、蛋白含量均降低，TLR4 mRNA的表达降低，TNF-α的含量减少，IκBα蛋白含量回升，说明APS对LPS引起的心肌细胞肥大有明显的抑制作用，且能有效降低TLR4的表达和炎症因子的释放，并呈一定的剂量依赖性，对心肌肥厚有一定的治疗作用。而IκBα特异性阻断剂 BAY11-7082对心肌细胞的肥大、炎症因子TNF-α的含量及TLR4 mRNA的表达均有抑制作用，说明抑制IκBα降解，可有效抑制LPS引起的心肌细胞肥大，这同APS的效果相同，据此我们推测APS对肥大心肌细胞的保护作用很可能是通过抑制TLR4的表达，阻碍 NF-κB 活化，抑制 IκBα 降解和炎症因子的释放，最终达到抑制炎症反应和心肌细胞肥大，保护心肌的目的。

心肌肥厚是一个复杂的病理过程，近年来有关TLR4对心肌肥厚、心衰的影响及黄芪多糖对TLR4表达影响等方面的研究均有报道，关于黄芪多糖在抑制心肌细胞肥大方面的研究甚少，本实验通过研究黄芪多糖对TLR4-NF-κB信号通路的影响，探讨了心肌细胞肥大的形成机制及黄芪多糖对心肌肥厚的保护作用机制，其具体的信号转导通路及作用点仍待进一步的具体研究。

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