丙戊酸对人脑胶质母细胞瘤细胞株抑制增殖及诱导凋亡作用研究

邵翠杰，杨俊霞

(江苏省麻醉学重点实验室，江苏徐州 221002)

丙戊酸(2-propylpentanoic acid，VPA)为经典的广谱抗癫痫药，是脑肿瘤手术后的常规用药。有研究显示［1］，它具有抑制组蛋白去乙酰化酶作用，组蛋白乙酰化修饰与肿瘤发生有关。组蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferase，HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDAC)参与决定组蛋白乙酰化状态［2］。HDAC是多亚基抑制物复合体的一部分，促使组蛋白去乙酰化，抑制基因转录;通过介导核小体结构改变和调节基因表达，参与细胞周期进程和分化，从而发挥生物学效应［3］。近年来发现［4］，HDAC抑制剂具有抑制肿瘤细胞增殖作用。如果能够证明 HDAC抑制剂——VPA在临床有效预防癫痫(1.0 mmol·L－1)的同时对胶质瘤也具有抑制增殖、促进分化、诱导凋亡等抗肿瘤作用，在临床上将达到一药多用，老药新用的效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人脑胶质母细胞瘤细胞株SF295和U87(来源于中山大学神经肿瘤实验室)用于本研究。RPMI 1640培养液、胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibcol公司)。四甲基偶氮噻唑蓝［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide，MTT］、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、琼脂糖、甲酰胺、过硫酸胺均购于美国Sigma公司;兔抗人单克隆抗体乙酰化H3、H4(Cell-signaling公司);丙戊酸(美国Sigma公司)。超净工作台、CO2细胞培养箱(Shel Lab)(日本SANYO公司)、酶标仪(Model 550 Bio-Rad)，凝胶成像系统(Bio-Rad)，流式细胞仪(BD FACS ∶Calibur)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 复苏冻存的胶质瘤细胞株SF 295、U 87，用含有体积分数为0.10胎牛血清的培养液(Roswell Park Memorial Institute，RPMI 1640)在37℃、体积浓度0.05 CO2、0.95饱和湿度的二氧化碳培养箱中常规传代培养，取对数生长期细胞进行试验。将细胞消化制成单细胞悬液，接种入96孔板中，100 μl/孔，每孔2 ×103～3 ×103个细胞。观察细胞的生长和贴壁情况。

1.2.2 药物处理 用纯乙醇将VPA稀释成为储存液(62.9 mmol·L－1)4℃冰箱保存。临用前用培养液稀释使其终浓度为0.2 mmol·L－1(脑脊液药物浓度)、0.6 mmol·L－1(血浆药物浓度)、1.0 mmol·L－1(抗癫痫药物浓度上限)、1.5 mmol·L－1、2.0 mmol·L－1、2.7 mmol·L－1(最小中毒浓度，开始出现嗜睡)、3.6 mmol·L－1(中毒浓度，开始出现昏迷)、4.5 mmol·L－1共8个不同浓度。处理细胞d 1－7，次日开始取96孔板做 MTT测定。每个浓度设置3个平行孔，重复3次。空白对照组含有同浓度的乙醇(浓度低于0.001 mmol·L－1)。

1.2.3 药物敏感性试验 MTT法检测药物对细胞活性的影响，酶标仪测定其光密度(optical density，OD)值。按照下列公式计算抑制率:抑制率/%=(1－试验组OD值)/(对照组OD值)×100%。实验重复3次。

1.2.4 检测细胞周期及凋亡 血清饥饿法对数生长的SF 295、U 87细胞株进行细胞周期同步化处理。然后加入VPA使之终浓度为1.0、2.0 mmol·L－1，分别于 d 1、d 3、d 5、d 7 收集细胞。流式细胞仪检测周期变化以及细胞凋亡率，Mod Fit软件分析周期，Cell Quest软件分析凋亡。实验重复3次。

1.2.5 Western blot 检测细胞周期相关蛋白表达:收集处理不同时间段的SF 295、U 87细胞，0.002 HCL提取细胞组蛋白，细胞裂解液处理提取细胞总蛋白。然后蛋白变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜、封闭、兔抗人乙酰化组氨酸 H3、H4(1∶500稀释)封闭过夜;鼠抗人β-actin做为内参(1∶5 000)。再加入1∶5 000羊抗兔、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗孵育，最后进行化学发光反应。实验重复3次。

2 结果

2.1 VPA抑制胶质母细胞瘤细胞生长 VPA对胶质母细胞瘤细胞株SF 295、U 87有抑制增殖作用，而且具有时间依赖性和浓度依赖性。其IC50值分别是 4.97、4.57 mmol·L－1。

配对t检验结果表明，1.0 mmol·L－1VPA对SF 295细胞抑制率的时间依赖性差异没有统计学意义(t=2.121，P=0.072)，但是对U 87细胞株抑制率的时间依赖性差异具有统计学意义(t=2.516，P=0.046)(Fig 1)。

2.2 VPA诱导细胞周期阻滞 1.0 mmol·L－1VPA对胶质瘤的细胞周期动力学产生影响，S期细胞减少，G1、G2/M期细胞数量相对增加，尤其对G2期阻滞作用具有明显的时间依赖性。药物作用24 h即出现明显S期细胞减少，G1、G2/M期细胞相对增多。配对t检验，1.0 mmol·L－1VPA对U 87细胞周期阻滞作用具有统计学意义(72 h后G2期细胞比例与对照组比较)(t=2.72，P=0.031);对SF 295细胞周期阻滞作用没有统计学意义(t=2.03，P=0.088)(Tab 1，Fig 2)。

Tab 1 Effects of 1.0 mmol·L-1VPA on cell cycle arrest ofG2-phase on glioblastoma cell lines(%，±s)

Tab 1 Effects of 1.0 mmol·L-1VPA on cell cycle arrest ofG2-phase on glioblastoma cell lines(%，±s)

*P＜0.05 vs U87 non VPA group

G2phase non VPA d 1 d 3 d 5 d 7 SF295 13.4 ±4.03 14.2 ±4.02 14.6 ±4.03 15.9 ±3.02 16.4 ±4.04 U87 10.5 ±3.05 13.4 ±5.01 17.8 ±6.1* 20.7 ±4.04*22.1 ±6.01*

2.3 VPA诱导细胞凋亡 1.0 mmol·L－1VPA诱导出现胶质瘤细胞凋亡极少;≥2.0 mmol·L－1VPA可以诱导出现胶质瘤细胞凋亡，且具有时间依赖性。U87细胞，药物处理d 7后凋亡细胞(0.072)的比例是未处理组(0.012)的6倍(t=4.02，P=0.005)。SF 295细胞药物处理72 h内未见凋亡细胞出现，d 7凋亡细胞比例比对照组增加1.3倍(t=1.92，P=0.407)，但差异有显著性(Tab 2)。

Fig 1 Effects of VPA on the viabilities of SF295，U87 time and concentration-dependently(VPA 1.0 mmol·L-1)

Tab 2 Effects of 2.0 mmol·L －1VPA on cell apoptosis of glioblastoma cell lines(% ， ± s)

Tab 2 Effects of 2.0 mmol·L －1VPA on cell apoptosis of glioblastoma cell lines(% ， ± s)

*P＜0.05 vs U87 non VPA group

Apoptosis non VPA d 1 d 3 d 5 d 7 SF295 5.8 ±1.03 2.9 ±1.02 5.6 ±2.03 7.9 ±3.02 15.1 ±3.04 U87 1.2 ±0.25 1.1 ±0.51 2.2 ±0.17 3.9 ±1.04 7.1 ±2.01*

2.4 VPA诱导组蛋白H3、H4表达 乙酰化组蛋白H3、H4在正常胶质瘤细胞株中有少量表达。1.0 mmol·L－1的 VPA 作用于 SF 295、U 87胶质母细胞瘤细胞株24 h后可以见到明显增加的乙酰化组蛋白H3、H4表达，直观表现为条带增粗，且随着时间延长表达量增加(Fig 3)。

Fig 2 Effects of 1.0 mmol·L－1VPA on cell cycle arrest of glioblastoma cell lines SF295，U87

Fig 3 Effects of 1.0 mmol·L －1VPA on acylated H3/H4 of glioblasma cell lines

3 讨论

丙戊酸是脑肿瘤术后用于预防癫痫的常规药物，其是否具有抗胶质瘤作用尚不明确。本实验结果显示 VPA(1.0 mmol·L－1，临床用于治疗癫痫的常规浓度)对恶性胶质母细胞瘤细胞株SF 295、U 87具有抑制生长增殖，周期阻滞作用，并且可以在蛋白水平改变乙酰化组蛋白的表达水平;增大剂量还可以诱导细胞凋亡。提示VPA在用于抗癫痫的同时，可能对胶质瘤的治疗发挥一定的作用。

HDAC抑制剂主要是通过改变组蛋白的乙酰化程度来改变染色质结构，从而调控基因表达［5］。VPA为HDAC抑制剂的一种，诱导胶质瘤细胞增殖的分子机制可能是:抑制HDAC活性，使组蛋白不能处于去乙酰化的状态，打破了乙酰化与去乙酰化之间的平衡，从而细胞核组蛋白乙酰化水平相对提高，激活核小体内一些相关因子的转录，从而将细胞阻滞在G1或者G2/M期，防止出现异常增殖而具有抗肿瘤作用。Li等［6］在髓母细胞瘤的研究过程中发现，VPA抑制肿瘤的作用与其诱导细胞周期阻滞相关，VPA使乙酰化组蛋白H3和H4增加可能是重要机制。本实验结果也发现胶质母细胞瘤细胞株在VPA处理后乙酰化组蛋白H3和H4明显增加。乙酰化组蛋白的增加能够使染色体保持高度乙酰化，核小体内染色体处在松弛状态，促进转录因子与DNA结合，使一些受抑制的基因重新恢复表达，发挥治疗肿瘤的作用。因此，与其他HDAC抑制剂(TSA、丁酸盐等)相似［7］，VPA 可能是通过改变肿瘤细胞组蛋白乙酰化状态来改变相关基因的转录水平，从而具有抗肿瘤作用。

目前对于VPA抗肿瘤的研究仍在进行中。本研究结果提示在临床抗癫痫的浓度(1.0 mmol·L－1)不能诱导出现胶质瘤细胞凋亡，而增加药物浓度(1.5 mmol·L－1)会诱导胶质瘤细胞出现自噬现象［8］，(2.0 mmol·L－1)就会诱导凋亡的出现，具体机制并不是很清楚。虽然增加VPA的浓度可以诱导出现胶质瘤细胞的自噬和凋亡，但是由于在临床用于抗癫痫的过程中，血药浓度不可能大于1.0 mmol·L－1的浓度，脑脊液中更不可能达到此浓度，因而本实验没有进一步进行关于大剂量、高浓度VPA诱导凋亡机制的研究。

VPA作为脱乙酰化酶抑制剂，可能是很有意义的胶质瘤病人临床辅助用药。

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