细胞色素P450 2E1在依达拉奉减轻免疫性肝损伤氧化应激中的作用

陈方军，李 俊

(1.安庆医药高等专科学校临床医学系，安徽安庆 246052;2.安徽医科大学药学院，安徽合肥 230032)

肝内免疫反应是病毒性肝损伤的重要机制之一，刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)可引起肝细胞膜脂质过氧化、氧自由基表达上调，导致肝细胞结构破坏和功能障碍，肝细胞变性、坏死，引起急性免疫性肝损伤［1］。依达拉奉是目前在临床试验中证明效果优越的自由基清除剂［2］，在对多种脏器损伤保护作用的研究中均提示自由基清除和抑制脂质过氧化的作用是其重要作用机制。因此，本课题拟采用Con A致小鼠急性免疫性肝损伤模型，探讨依达拉奉对急性实验性肝损伤的保护作用和部分机制，以期为进一步拓宽依达拉奉的临床应用提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 化学试剂 ConA购自 Sigma公司，规格为100mg;依达拉奉注射液由吉林博大制药公司提供;丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TB)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所;DEPC H2O、TRIzol试剂购自Invitrogen公司;RT－PCR试剂盒购于Promega公司，特异性引物由上海生物工程技术和服务公司合成;CYP 2E1抗体购于Upstate公司。

1.2 主要仪器 美国Biometra公司垂直电泳系统和梯度PCR仪;DU2600紫外分光光度计，BECKMAN公司;高速冷冻离心机，BECKMAN公司。

1.3 动物处理 BALB/c小鼠60只，♂，体质量18～22 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验前适应性喂养1周，自由饮食，维持12 h光照和12h黑暗的昼夜节律，温度20℃ ～25℃，相对湿度(50±5)%。将健康小鼠随机分为6组，每组10只:正常对照组、Con A肝损伤组、依达拉奉(4、8、16 mg·kg－1)处理组、还原性谷胱甘肽(50 mg·kg－1)处理组。所有小鼠在给药前均禁食1 h，给药组于给予Con A前24 h、8 h和1 h分别腹腔注射相应剂量依达拉奉和还原性谷胱甘肽。正常组小鼠尾静脉注射PBS溶液0.3 ml，其他各组按 Con A 20 mg·kg－1以PBS溶液稀释为0.3 ml尾静脉注射造模，在末次给药后禁食6 h取材，眼眶静脉丛采血，血清用来测生化指标;颈椎脱臼处死小鼠，取相同部位肝脏用于总RNA的提取、蛋白质免疫印迹分析和组织病理学检查。

1.4 血清肝生化指标检测 血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)检测严格按试剂盒规范操作。

1.5 肝组织病理检查 肝组织置于4%多聚甲醛中固定。经乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、5 μm连续切片、HE染色、中性树脂封片后，光学显微镜下观察肝脏组织病理改变。

1.6 肝匀浆SOD活力、GSH水平、MDA含量检测用冷生理盐水制备10%肝匀浆，检测肝组织中SOD活力及GSH、MDA含量。GSH水平用Griffith法检测。通过测定脂质过氧化的羰基产物MDA含量反映组织的氧化应激水平，MDA含量测定采用TBARS 比色法［3］。

1.7 总RNA的分离和逆转录 50 mg小鼠肝脏组织用TRIzol试剂盒提取总RNA。DNA酶消化基因组DNA。通过测定260 nm波长下样品的吸光度值确定样品中RNA含量，用琼脂糖凝胶电泳技术检测RNA的完整性。每份样品中取1 μg总RNA用于合成cDNA。20 μl逆转录反应体系中含25 mmol·L－1Tris · HCl(pH 8.3)、37.5 mmol·L－1KCl、10 mmol·L－1DTT、1.5 mmol·L－1MgCl2、10 mmol·L－1dNTP、0.5 mg oligo(dT)15引物及 20 U 逆转录酶。反应体系在42℃孵育60 min后，在95℃中止逆转录反应。

1.8 PCR扩增 50 μl PCR反应体系中含2.5 μl cDNA、1 × PCR 缓冲液、1.5 mmol·L－1MgCl2、200 μmol·L－1dNTP混合物、1 U耐热性DNA聚合酶、1 μmol·L－1正向引物和逆向引物。使用GAPDH做内对照。CYP2E1基因引物序列:正向，5'-AGT GTT CAC ACT GCA CCT GG-3';逆向，5'-CCT GGA ACA CAG GAA TGT CC-3'，片段长度为125 bp。GAPDH基因引物序列为:正向，5'-GAG GGG CCA TCC ACA GTC TTC-3';逆向，5'-CAT CAC CAT CTT CCA GGA GCG-3'，片段长度为340 bp。CYP2E1扩增条件为:94℃预变性3 min，1个循环;94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃ 延伸 1 min，35 个循环。GAPDH PCR扩增条件为:94℃预变性3 min，1个循环;94℃变性30 s，56℃退火30s，72℃ 延伸 1 min，30 个循环。末次循环后 72℃孵育 10 min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶(含0.5 μg·L－1溴化乙锭)电泳45 min后鉴定分析。

1.9 蛋白质免疫印迹 称取0.1 g肝脏组织样品，加入1 ml RIPA 裂解液(pH 7.4，50 mmol·L－1Tris-HCl、150 mmol·L－1NaCl、1% 脱氧胆酸钠、1%Triton X-100、0.1%SDS、1 mmol·L－1EDTA 和 1 mmol·L－1PMSF)置于冰上匀浆裂解 30 min，再以15 000×g离心15 min，取上清液后蛋白定量至10 g·L－1，接着加入2×上样缓冲液混匀，沸水浴5 min使蛋白变性，－20℃贮存。50 μg蛋白样品经10%SDS-PAGE凝胶垂直电泳分离后电转移至PVDF膜上，膜于5%脱脂牛奶中4℃封闭过夜后室温孵育一抗CYP2E1(1 ∶2 500)、或 β-actin(1 ∶2 000)2 h，以DPBS-T洗膜40 min，接着将膜于室温孵育二抗(山羊抗兔IgG)2 h，以DPBS-T洗膜40 min后再以DPBS浸洗10 min。最后用化学发光法(ECL)显迹，X线压片曝光成像。

1.10 统计学处理 CYP2E1 mRNA水平以内参GAPDH标准化，对照组的光密度标定为 1。CYP2E1蛋白水平以内参β-actin标准化，对照组的光密度值标定为1。所有计量资料试验结果用±s的方式表示，方差分析和SNK方法检验各组之间差异。

2 结果

2.1 依达拉奉对免疫性肝损伤小鼠血清生化指标的影响 见Tab 1，与正常组相比，ConA模型组大鼠血清 ALT、AST 明显升高，依达拉奉(4、8、16 mg·kg－1)、还原性谷胱甘肽处理组血清ALT、AST水平均较正常组升高，比模型组有明显下降(P＜0.05，P＜0.01)。(Tab 1)

Tab 1 Effects of edaravone on serum ALT and AST concentration in mice with ConA-induced immune hepatic injury(±s，n=10)

Tab 1 Effects of edaravone on serum ALT and AST concentration in mice with ConA-induced immune hepatic injury(±s，n=10)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model;△△P＜0.01 vs normal

Group Dose/mg·kg－1 ALT/U·L－1 AST/U·L －1 Normal 0 29.6 ±1.8 59.3 ±3.9 Model 0 41.6 ±2.6△△ 91.5 ±4.8△△Edaravone 4 37.5 ±2.9* 78.6 ±4.7*8 36.2 ±2.7* 72.8 ±4.2*16 31.6 ±2.6＊＊ 65.5 ±5.2＊＊GSH 50 32.7 ±3.9* 66.8 ±5.7＊＊

2.2 依达拉奉对免疫性肝损伤小鼠引起肝脏组织脂质过氧化和GSH消耗、SOD活力的影响 结果显示，与正常组比较，模型组小鼠肝匀浆中MDA的含量明显上升，而SOD活性、GSH的含量明显降低。与模型组比较，依达拉奉(8、16 mg·kg－1)能明显降低用药组小鼠肝匀浆中MDA的含量，明显升高SOD活性和GSH含量(P＜0.01，Tab 2)。

Tab 2 Effects of edaravone on MDA，SOD and GSH in liver homogenate in mice with Con A-induced immune hepatic injury(±s，n=10)

Tab 2 Effects of edaravone on MDA，SOD and GSH in liver homogenate in mice with Con A-induced immune hepatic injury(±s，n=10)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model;△△P＜0.01 vs normal

Group Dose/mg·kg－1 MDA/μmol·g－1Pro SOD/U·mg－1Pro GSH/mg·g－1Pro Normal 0 3.01 ±0.35 23.01 ±0.57 5.21±0.27 Model 0 7.23±1.11△△ 15.11±1.66△△ 2.96±0.36△△Edaravone 4 6.01 ±0.81＊＊ 16.45 ±2.02* 3.32±0.23*8 4.95±0.35＊＊ 18.24±0.88＊＊ 3.77 ±0.25＊＊16 3.74±0.71＊＊ 19.41±1.09＊＊ 4.32±0.63＊＊GSH 50 3.62±0.34＊＊ 20.85±0.63＊＊ 4.45±0.42＊＊

2.3 依达拉奉对小鼠肝脏病理组织学变化的影响

如Fig 1所示，正常组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐，未见变性与坏死。模型组轻度空泡变性，肝小叶界限模糊，炎细胞浸润，部分位置细胞核溶解、坏死。还原性谷胱甘肽处理组病变较轻，但仍有少量标本炎细胞浸润和散在点状坏死;依达拉奉小剂量组各标本均有散在点状坏死、轻度脂肪变性和炎性细胞浸润;依达拉奉中剂量组未见散在点状坏死，各标本仍见少量炎性细胞浸润和轻度脂肪变性;依达拉奉大剂量组肝细胞排列较整齐，肝细胞损伤程度明显减轻，炎性细胞浸润显著减少。

Fig 1 Effects of edaravone on liver histopathology in mice with ConA-induced immune hepatic injury(HE stained，×200)

2.4 依达拉奉对免疫性肝损伤小鼠肝脏组织CYP 2E1 mRNA水平的影响 结果显示，与正常组比较，模型组小鼠肝组织CYP 2E1 mRNA明显上升(P＜0.01);与模型组相比，依达拉奉(8、16 mg·kg－1)处理组降低了肝脏组织CYP 2E1 mRNA表达(P＜0.01，Fig 2)。

2.5 依达拉奉对肝脏组织CYP 2E1蛋白表达水平的影响 结果显示，与模型组相比，依达拉奉组(8、16 mg·kg－1)明显的抑制了肝脏组织CYP 2E1蛋白表达水平。

Fig 2 mRNA expression of CYP2E1 in the mouse liver tissue of each group

Fig 3 Expression of CYP2E1 protein level in mouse liver tissues of each group

3 讨论

ConA诱发的小鼠免疫性肝损伤是常用的肝损伤实验动物模型。ConA是对肝细胞具有特异性毒性作用的植物凝集素，其基本病理特点是在体外可激活T细胞的丝裂原而致免疫性肝损伤，与人类慢性肝炎病变非常接近，且有肝脏特异性和靶向性，因此非常适合研究人类病毒性肝炎、自身免疫性肝病等的病理机制和进行抗肝损伤的药物筛选［4］。本实验血清学显示ConA模型组肝细胞损伤，转氨酶升高;病理学提示，肝细胞水肿、气球样变性、炎性细胞浸润，符合病毒性肝炎、自身免疫性肝病等的表现。

依达拉奉对自由基毒性损伤具有强大的抑制作用，在神经系统疾病脑出血、脑梗死等疾病具有确切疗效，能够减轻自由基导致的级联损伤，由于其独特的清除自由基作用，其适应证临床应用更加广泛［5］。本文在BALB/c小鼠预防性给予依达拉奉后，与模型组比较，依达拉奉能明显降低ConA小鼠血清ALT、AST水平，病理组织学检查显示小鼠肝脏的炎症程度明显减轻。提示依达拉奉对免疫性肝损伤小鼠具有明显的治疗作用。

SOD是保护肝脏细胞器免受自由基攻击的重要的抗氧化物质，MDA是脂质代谢的终产物，具有很强的细胞毒性，GSH水平反映机体抗氧化能力，其下降表明机体抗氧化能力下降，生成自由基增加［6－7］。本实验结果显示依达拉奉可以明显升高免疫性肝损伤小鼠肝脏SOD水平，减少MDA的生成，升高了降低的GSH水平，减轻脂质过氧化反应，改善由过氧化反应引起的肝损伤。提示依达拉奉防治小鼠免疫性肝损伤的机制可能与其提高机体抗氧化能力、保护肝细胞器免受自由基的攻击有关。

CYP450酶系是机体中催化外来物进行代谢的主要酶系，可通过氧化或环氧化反应产生有害的代谢产物。CYP2E1是肝脏I相代谢酶细胞色素P450家族的主要亚型之一，众多的环境化学物质进入机体后可经CYP2E1代谢活化而具有细胞毒性，许多毒物(包括致癌物)也可经 CYP2EI激活;同时，CYP2E1也是细胞色素P450中产ROS活性最强的亚型，CYP 2El可以引起许多毒性物质的代谢和激活，催化产生活性氧物质，如超氧阴离子基团和过氧化氢等，与氧化应激关系密切［8］。研究结果显示，依达拉奉处理组明显降低了肝脏组织CYP 2E1 mRNA表达以及CYP 2E1蛋白水平，提示抑制肝脏CYP2E1过度表达是依达拉奉治疗免疫性肝损伤的机制之一，通过调节CYP450的功能来调节免疫性肝损伤的氧化代谢，减少氧自由基的生成，减弱氧化应激损伤，从而起到一定的肝脏保护作用。

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