毛细管电泳法测定头孢羟氨苄胶囊中头孢羟氨苄的含量

邵 红

郑州人民医院，河南郑州 450000

头孢羟氨苄为第一代口服头孢菌素，临床上主要用于治疗敏感菌所致的尿路感染，呼吸道感染，皮肤软组织感染和中耳炎等。毛细管电泳具有操作简便，分离效率高和易于自动化等优点，被广泛应用于抗生素的分析研究中。有文献报道采用近红外光谱法[1]、分光光度法[2]、导数光谱法[3]和高效液相色谱法[3-6]测定头孢羟氨苄，目前尚未见采用毛细管电泳分析头孢羟氨苄的报道。该研究通过对影响毛细管电泳分离因素的考察，建立测定头孢羟氨苄胶囊中头孢羟氨苄含量的毛细管电泳法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

P/ACE MDQ 毛细管电泳仪，二极管阵列检测器，熔融石英毛细管柱（50cm×75 m，有效长度37cm），超纯水器，BP211D1/10 万天平,pHS-3C pH 计。

1.2 试剂

头孢羟氨苄对照品（纯度>95.0%），内标盐酸班布特罗对照品（批号200705C01），头孢羟氨苄胶囊（规格250 mg/粒）,水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 内标溶液的配制 精密称取班布特罗适量，置于100 mL容量瓶，加水溶解并稀释至刻度，即得浓度为10.0 mg/mL 的内标溶液。

2.1.2 对照品溶液的配制 精密称取头孢羟氨苄对照品适量，置于50 mL 容量瓶，加水溶解并稀释至刻度，即得浓度为10.0 mg/mL的对照品溶液。

2.1.3 样品溶液的配制 取20 粒头孢羟氨苄胶囊内容物共3 批，精密称定，研细，分别称取3份相当于各自平均片重的量置于100 mL 容量瓶中，加水充分溶解后用水稀释至刻度，摇匀，用0.45 m 滤膜过滤，取续滤液即得样品溶液。

2.2 电泳条件

熔融石英毛细管柱：50 cm×75 m，有效长度37 cm；运行缓冲液：50mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH值5.0）；工作电压：25 kV；电压进样：10 kV×5 s；柱温25℃；检测波长230 nm；毛细管在每次运行前用0.1 mol/L 氢氧化钠溶液、超纯水各冲洗5 min，运行缓冲液冲洗10 min，在2次运行之间用缓冲液冲洗3 min。

3 结果

3.1 头孢羟氨苄对照品及内标

（A）和样品中头孢羟氨苄及内标（B）的CE 图,见图1。

图1 对照品（A）和样品（B）的CE 图

3.2 线性试验

精密量取适量的对照品溶液和内标溶液，分别置10 mL 容量瓶中，加水稀释成含内标物浓度为0.5mg/mL，对照品浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL 的溶液。按优化后的电泳条件进样，以对照品浓度（X）为横坐标，对照品与内标物峰面积的比值（Y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：Y=11.363X-0.0206,r=0.9996。结果表明，头孢羟氨苄浓度在0.5～3.0 mg/mL 范围内线性关系良好。

3.3 精密度试验

取3.0mg/mL 对照品溶液,按优化后的电泳条件重复进样6次，头孢羟氨苄对照品与内标班布特罗峰面积比的RSD 为1.12%，头孢羟氨苄对照品迁移时间的RSD 为0.89%，班布特罗迁移时间的RSD 为0.93%。

3.4 加样回收率试验

取20 粒已知含量的头孢羟氨苄胶囊内容物，研细，精密称取相当于头孢羟氨苄125 mg 的粉末9份,分别精密加入头孢羟氨苄对照品适量,内标溶液5.0 mL,置于100 mL 容量瓶中，加水充分溶解后用水稀释至刻度，摇匀，用0.45 m 滤膜过滤，取续滤液，按优化后的电泳条件进样，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果[n(%)]

3.5 样品测定

精密量取内标溶液0.5 mL，置于10 mL 容量瓶，加样品溶液至刻度，按优化后的电泳条件进样，按回归方程计算含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果

4 讨论

4.1 检测波长的选择

应用二极管阵列检测器对头孢羟氨苄和内标班布特罗进行扫描，发现头孢羟氨苄和班布特罗在230 nm 和270 nm 处均有较强吸收。在230 nm 处，头孢羟氨苄和班布特罗吸收较强，峰形较好，且基线稳定；在270 nm 处，虽然两者也有较强的吸收，但峰形相对较差，且基线出现波动。因此，选择230 nm 为检测波长。

4.2 内标的选择

内标的选择，首先考虑了与头孢羟氨苄结构相似的氨苄西林，通过改变分离电压、柱温、缓冲液的浓度和pH 等实验条件，不能达到基线分离。然后选择班布特罗，通过优化分离条件，能够与头孢羟氨苄基线分离，且迁移时间与头孢羟氨苄相近。因此，选择班布特罗为内标物。

4.3 分离电压的选择

分离电压越大，药物的迁移时间越短，但毛细管中焦耳热增大，从而使柱效和分离度降低；分离电压越小，药物的迁移时间延长，峰形变宽，使分离度降低。分别考察了分离电压15 kV，20 kV，25 kV，30 kV。结果显示，分离电压为15 kV、20 kV时，两者虽然能够分离但迁移时间较长，分离效率较低；分离电压为30 kV时，迁移时间太短，两者不能得到很好地分离；分离电压为25 kV时，两者能达到基线分离，峰形较好，且迁移时间适中。因此，选择25 kV 为分离电压。

4.4 温度的选择

柱温升高，溶液粘度降低，药物迁移时间缩短，分离效率提高；但温度过高，会引起焦耳热增大，柱效和分离度也随之降低。分别考察了柱温15 ℃，20 ℃，25 ℃，30 ℃。结果显示，柱温为25 ℃时两者能基线分离，且迁移时间适中。

4.5 缓冲液pH值的影响

缓冲液的pH 是影响毛细管电泳分离的关键因素。缓冲液pH越高，电渗流也越高，使药物迁移时间缩短，但过高的pH值会使分离度下降。本文考察了pH值4.0，pH值4.5，pH值5.0，pH值5.5的50 mmol/L 磷酸盐缓冲液。结果显示，选用pH值4.0 和pH值4.5的磷酸盐缓冲液时，两者虽然能够分离，但分析时间较长；选用pH值5.5 的磷酸盐缓冲液时，分析时间缩短，但两者不能很好的分离；选用pH值5.0 的磷酸盐缓冲液时，两者能达到基线分离，迁移时间适中，且能获得良好的峰形。

4.6 缓冲液浓度的影响

缓冲液浓度越高，电渗流越低，使分离度得到提高，同时分析时间延长，但缓冲液的浓度过高，会产生焦耳热效应，使色谱峰展宽，分离度下降。该文考察了30 mmol/L，50mmol/L，70mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH值5.0）。选用30 mmol/L 磷酸盐缓冲液时，两者不能很好的分离；选用70 mmol/L 磷酸盐缓冲液时，分析时间变长，色谱峰展宽，分离度下降；选用50 mmol/L 磷酸盐缓冲液时，头孢羟氨苄和班布特罗能得到较好分离。因此，选择50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH值5.0）。

[1]郄冰冰,王润彪,刘云.近红外光谱法测定头孢羟氨苄胶囊含量[J].中国药事，2010,24(9):892-893,912.

[2]张亚秋.茚三酮比色法测定头孢羟氨苄[J].理化检验-化学分册,2011,47(8):966-967.

[3]El-Gindy A,El Walily AF,Bedair MF.First-derivative spectrophotometric and LC determination of cefuroxime and cefadroxil in urine [J].J Pharm Biomed Anal,2000,23(2/3):341-352.

[4]刘云,朱建平,韩彬.HPLC 法测定头孢羟氨苄原料及其制剂中有关物质的研究[J].中国药品标准,2011,12(3):174-178.

[5]陈玉华.头孢羟氨苄甲氧苄啶分散片的含量测定研究[J].海峡药学,2010,22(8):70-73.

[6]Samanidou VF,Hapeshi EA,Papadoyannis IN.Rapid and sensitive high performance liquid chromatographic determination of four cephalosporin antibiotics in pharmaceuticals and body fluids [J].J Chromatogr B,2003,788(1):147-158.