高效液相色谱法测定眼氨肽滴眼液中醋酸氯己定的含量*

周朝东，黄哲甦

(天津市药品检验所，天津 300070)

眼氨肽滴眼液系由牛、羊或猪等动物眼为原料，经乙醇提取后加适量的防腐剂制成的滴眼液。该制剂含有多种氨基酸(主要为谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸及赖氨酸)、多肽、核苷酸及钠、钾、钙、镁等微量元素。该制剂具有激活酶的功能，激活肌体防御系统，增强防御功能，并能减轻或阻断其病理过程，促进眼组织的新陈代谢、伤痕愈合和吸收炎症渗出，并能促进眼角膜上皮组织的再生［1］，临床上用于角膜炎、视力疲劳及青少年假性近视等。根据《中国药典》2010年版的要求，滴眼液中可加入适宜浓度的抑菌剂，以保证在使用期间能够抑制细菌的生长与繁殖，保证用药过程的安全性，但过量抑菌剂对人体也会产生毒害作用。目前有部分企业在眼氨肽滴眼液中加入醋酸氯己定作为抑菌剂。醋酸氯己定又称醋酸洗必泰，对革兰阳性菌和阴性菌的抗菌作用强，对真菌有效，常用于器械、皮肤及黏膜的消毒［2］。本实验参考相关文献［3，4］，建立高效液相色谱的方法对眼氨肽滴眼液中醋酸氯己定进行含量测定，以便于对眼氨肽滴眼液中醋酸氯己定含量进行控制，保证药品的安全性。

1 仪器与试药

岛津LC2010A 高效液相色谱仪，CLASS -VP 色谱工作站;METTlER TOLEDO xs205 型十万分之一电子天平;醋酸氯己定对照品(中国食品药品检定研究院，批号为100183 -201003);眼氨肽滴眼液(市售品，批号为120101、101101、111106);乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:welch materials AQ - C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为0.02 mol/L 磷酸二氢钾(磷酸调节pH 至2.5)-乙腈(70∶ 30 )，流速为1.0 ml/min，柱温为40 ℃，检测波长为254 nm，进样量20 μl;理论板数按醋酸氯己定峰计算，不少于4000，与相邻峰分离度符合要求。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取醋酸氯己定对照品适量，加流动相溶解并稀释至每1 ml 含0.1 mg 的溶液，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取供试品直接进样分析。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 取不含抑菌剂醋酸氯己定的供试品溶液进样分析。分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，结果见图1。

图1 对照品(A)阴性对照(B)供试品(C)HPLC 色谱图

2.3 方法学考查

2.3.1 线性关系考查 精密称取醋酸氯己定对照品约10 mg 置10 ml 量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密量取0.5、0.75、1、1.25 和1.5 ml置10 ml 量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。分别精密量取20 μl 注入液相色谱仪进行分析。以浓度对峰面积进行线性回归，回归方程为A =58 357 653 C-52 212，(r=0.9999，n =5)。结果表明，醋酸氯己定浓度在0.05 ～0.15 mg/ml 范围内与其峰面积呈良好线性关系。

2.3.2 精密度试验 取醋酸氯己定对照品溶液20 μl，连续进样5 次。按上述色谱条件测定，结果峰面积RSD 为0.25%(n=5)，表明仪器精密度良好。

2.3.3 检出限和定量限 精密称取醋酸氯己定对照品约10 mg，置50 ml 容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，然后进行系列稀释，以信噪比S/N=3∶ 1 作为检出限，其检出限为0.26 ng，以信噪比S/N=10∶ 1 作为定量限，定量限为0.52 ng。

2.3.4 稳定性试验 取对照品溶液，分别在0、3、6、12和24 h 进样。结果峰面积的RSD 为0.26%(n =5)，表明醋酸氯己定在24 h 内稳定。

2.3.5 加样回收试验 精密称取醋酸氯己定对照品约25 mg，置25 ml 量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1 ml 置10 ml 量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。然后分别精密量取0.8、1.0 和1.2 ml 各3 份，分别置10 ml 量瓶中，用不含醋酸氯己定的眼氨肽滴眼液供试品溶液稀释至刻度，摇匀。精密量取20 μl 注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算含量，结果平均回收率为99.84%，RSD 为0.42%，见表1。

表1 加样回收试验结果

2.4 供试品含量测定 对3 批样品按上述色谱条件进行含量测定，结果见表2。

表2 样品含量测定结果

3 讨论

醋酸氯己定具有较强的抑菌、杀菌作用，主要通过破坏细菌胞浆膜的渗透屏障，使细菌的生长繁殖受到抑制和破坏而产生抗菌作用［5］。滴眼液中加入醋酸氯己定可以有效地抑制滴眼液在频繁开启使用中细菌的生长和繁殖，保证用药过程中的安全性。本法参考其他文献资料，选用welch materials AQ -C18色谱柱，采用磷酸盐和乙腈比例为70∶ 30 的流动相，在此色谱条件下醋酸氯己定的理论板数约为5000，峰形较好，保留时间约为8.5 min，能够与相邻的未知峰达到有效的分离，并且分析时间也很合适。此外利用本法对眼氨肽滴眼液中的防腐剂醋酸氯己定进行了方法学的研究并进行了含量测定，结果良好。最后利用本法测定滴眼液中防腐剂醋酸氯己定，方法简单、快捷及重复性好，适用于滴眼液中醋酸氯己定的含量测定。

1 陈新谦. 新编药物学［M］. 第14 版. 北京:人民卫生出版社，1998:599

2 唐健. 醋酸氯己定栓剂的制备及质量控制［J］. 中南医学科学杂志，2011，39(2):227

3 周燕飞. HPLC 法测定醋酸氯己定子宫灌注液的含量［J］. 中国兽药杂志，2010，44(5):31

4 卢素格，刘红丽，杨瑞春. 高效液相色谱测定皮肤消毒液中醋酸氯己定的含量［J］. 中国消毒学杂志，2011，28(3):317

5 雍德卿.新编实用医院制剂注释［M］.第2 版. 北京:人民卫生出版社，2004:139 -140