分子印迹技术在中药提取分离中的应用

广州市妇女儿童医疗中心，广东 广州 510623

分子印迹技术在中药提取分离中的应用

张雅雯

广州市妇女儿童医疗中心，广东 广州 510623

分子印迹技术是获得在空间和结合位点上与模板分子完全匹配的聚合物的制备技术。本文综述了分子印迹技术的原理、分类、制备以及在中药分离纯化中的应用，并对其面临的问题及应用前景进行了展望。

分子印迹技术；分子印迹聚合物；中药；分离提取

分子印迹技术(Molecular Imprinting Technique，MIT)是获得在空间和结合位点上与模板分子完全匹配的聚合物的制备技术，这种技术源于抗体-抗原专一性的认识，利用具有分子识别能力的聚合物材料——分子印迹聚合物(Molecular Imprinting Polymer，MIP)来分离、筛选、纯化化合物的一种仿生技术[1]。1949年Dickey提出了“分子印迹”概念[2]，20世纪90年代Wulff研究小组利用酶和抗体具有分子形状、空间结构选择性的特点，发展了用于色谱手性拆分的MIP。由于MIP具有高选择性和特异性识别能力，以及物理化学性质稳定、耐酸碱、抗高压、使用寿命长等特点，使该技术在固相萃取剂、模拟酶催化、化学传感器、农残分析、环境监测、药物的提取分离与控释等方面得到广泛的应用。现对MIT在中药分离纯化中的应用综述如下。

1 分子印迹技术

1.1 原理及分类 根据分子印迹聚合物与模板分子在聚合过程中相互作用的机理不同，分子印迹技术可分为预组装法、自组装法和结合法。

1.1.1 预组装法 又称共价法，该方法主要由Wulff等创立[3]。应用预组装法合成MIP过程中，模板分子通过可逆的共价键与功能单体结合，加入交联剂形成聚合物后，模板分子通过破坏共价键的方式而被去除。这类MIP的选择性与交联剂的用量直接相关，但由于可逆性共价反应的限制，能够利用这种方式制备MIP的模板分子非常有限，因此预组装法发展较为缓慢。

1.1.2 自组装法 又称非共价法，目前MIP的制备多数采用这种方法。模板分子和功能单体通过通过氢键、偶极作用、离子化作用、金属配位键、疏水作用、静电作用、范德华力等多种非共价键作用力生成分子自组装体[4]，在加入交联剂形成聚合物后，这种复合物被保留下来。大多数化合物都能够通过非共价作用与功能单体结合，因此，自组装法具有更广阔的应用前景。

1.1.3 结合法 又称半共价法，是将共价键印迹和非共价键印迹相结合的一种印迹方法[5]。结合法最早是由White-Comb领导的研究小组于1995年提出[6]，在此方法的基础上Wulfson领导的研究小组又提出“牺牲空间法””[7]，其实质仍然是预组装法和自组装法的结合法。在MIP制备过程中，模板分子和功能单体通过共价键形成复合物，在去除模板分子后，目标分子与分子印迹物通过非共价键的相互作用而被特异性识别。该方法制备的MIP不但具有专一性强的特点，并且在动力学上能快速平衡，结合了共价合成法和非共价合成法的双重优势。

1.2 制备方法 根据分子印迹聚合物的用途和不同性能要求，可以选择多种MIP制备方法，主要包括本体聚合法、悬浮聚合法、沉淀聚合法、表面印迹法等方法。

1.2.1 本体聚合法 本体聚合是将模板分子、功能单体和交联剂按一定比例混合于致孔剂中，经聚合形成MIP，再由机械研磨成所需要尺寸的粒子。该方法制备的MIP对模板分子仍能保留良好的识别能力和选择性，并且合成过程易于控制，不需要特别复杂的仪器设备，便于普及。朱林敏等[8]采用本体聚合法首次合成了丹酚酸A分子印迹聚合物，并优化了最佳的聚合条件。在甲醇溶液中，利用静态平衡吸附实验和Scatchard 模型评价了丹酚酸A分子印迹聚合物的吸附特性。结果表明，在所考察的浓度范围内，与空白聚合物相比，丹酚酸A分子印迹聚合物对丹酚酸A有较高的吸附量，且丹酚酸A分子印迹聚合物中形成了2类不同的结合位点。

1.2.2 悬浮聚合法 悬浮聚合一般由有机单体、乳化剂、引发剂以及水组成，具体过程是：向混合有模板分子、功能单体以及交联剂的溶液中加入乳化剂和交联剂后，在水中聚合形成较均一的球状聚合物。为提高香草醛的提取和使用价值，丁俊红等[9]以香草醛为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)为交联剂，采用紫外辐照引发悬浮聚合制备了香草醛MIP微球，辐照引发悬浮聚合制备的印迹聚合物具有较均匀的粒径分布和良好的等温吸附性能，并且表现出良好的特异吸附性能，MIP对于香草醛及邻香草醛的分离因子为2。

1.2.3 沉淀聚合法 沉淀聚合是一种非均相溶液聚合，其原理是生成的MIP在溶剂中彼此分散，当MIP在溶剂中达到饱和时，会产生相分离，最终获得粒径均一的微球聚合物。这种方法对溶剂要求严格，其原则是选择粘度低、具有高流动性的溶液，从而保证低聚物的均匀分散，避免聚集粘连。谢珍茗等[10]以冬凌草甲素为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，用本体聚合法和沉淀聚合法制备了分子印迹聚合物。结果表明在弱极性溶剂氯仿中，采用沉淀聚合法制备的MIP印迹效率相对比以四氢呋喃为致孔剂制备的MIP本体聚合物印迹效率高，且能很好地识别冬凌草甲素，展现了良好的应用前景。

1.2.4 表面印迹法 表面印迹法是把印迹分子和功能单体在溶剂中形成的复合物，与表面活化过的硅胶/聚三羟甲基丙烷三丙烯酸酯粒子/玻璃等介质反应接枝聚合，从而制得MIP的一种方法。周进康等[11]在硅胶表面接枝乙烯基三乙氧基硅烷得到接枝硅胶，将其与模板分子丹参素、功能单体4-乙烯基吡啶、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯等，在偶氮二异丁腈引发作用下进行聚合反应，制备丹参素分子MIP。该MIP对丹参素具有较大的吸附容量、较短的吸附时间和良好的选择性，相对于空白印迹聚合物的印迹因子可达1.93，印迹聚合物对模板分子和其结构类似物的吸附之比达到2.19。

此外，近年来还发展了封管聚合法[12]、电聚合[13]、分散聚合[14]等新方法。新的MIP制备方法进一步提高了印迹容量，是分子印迹技术研究领域的重要发展方向。

2 MIP在中药提取分离中的应用

高效液相色谱法、硅胶柱色谱法等常规的分离方法，溶剂消耗量大、效率低，且容易造成微量的有效成分丢失。以中药活性物质为模板制备的MIT，正是具有分子识别性强、固定相制备简便快速、操作简单、性质比较稳定(耐酸碱、耐高温、高压等)、溶剂消耗量小、模板和MIP都可以回收再利用等优点，在中药活性成分的分离、分析中具有很好的应用前景。

2.1 活性成分的提取分离 在中草药等天然产物的分离提取中，由于样品成分复杂多样，使用传统的液液萃取及层析柱方法分离，不仅溶剂消耗量大而且对环境污染严重，分离技术的工业化实施受到制约。MIT作为一种新的分离技术，常用于中药活性成分的分离纯化。冯建涌等[15]以长春碱为模板分子制备了长春碱MIP，将制备的长春碱MIP填充于固相萃取小柱中，依次用不同比例的甲醇-冰醋酸溶剂洗脱，分离长春花提取物中的长春碱。研究发现，以甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂、甲苯为致孔剂采用本体聚合的方法制备的长春碱MIP，存在模本分子抽提不完全导致渗漏的问题，影响了该聚合物分子识别性能的评价，通过选择和优化上样、淋洗及洗脱等条件，成功分离、富集长春花提取物中的长春花碱。潘浪胜等[16]采用分子印迹技术，以木犀草素为模板分子，丙烯酰胺为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，通过热引发聚合，制备了木犀草素分子印迹聚合物，并通过装入固相萃取柱研究了聚合物对木犀草素的选择性能。木犀草素分子印迹固相萃取柱具有较好的稳定性和耐用性能，使用4次后其选择识别性能仍未降低，其研究结果对从复杂的天然产物中高效分离富集黄酮类活性成分木犀草素有一定的指导作用。向海艳等[17]采用分子印迹技术，以白藜芦醇为模板分子，丙烯酰胺为功能单体，EDMA为交联剂，合成了对白藜芦醇具有较好选择性的MIP，通过静态平衡结合法以及Scatchard分析法研究该聚合物的结合性质和选择性能，用于中药虎杖提取物中白藜芦醇的分离，取得较好效果。朱秀芳等[18]以橙皮苷为模板分子，在甲醇中制备了橙皮苷MIP，采用平衡吸附实验方法研究了聚合物的吸附性能和选择性能，探讨了聚合物的印迹机理和识别机理。机理研究表明，识别位点来自丙烯酰胺与橙皮苷苯甲酰系统的氢键作用，吸附溶液中氢键竞争试剂的存在对聚合物的识别性能有显著影响，该聚合物能选择识别复杂样品中的橙皮苷分子，具有一定的应用潜能。

2.2 有效组分群的分离 分子印迹的分子识别特点，使其很可能发展成为一种选择性分离材料用于萃取分离中药中具有特定药效结构的有效成分群。程绍玲等[19]以葛根素为模板分子，丙烯酰胺为单体，EDMA为交联剂，制备了葛根素MIP，并用葛根素MIP对葛根素提取物进行了分离。结果表明，该MIP对模板分子葛根素印迹效果较强，得葛根素回收率为83%，远高于用大孔吸附树脂的分离效果，除分离出葛根素外，还有其它两种异黄酮类成分。周力等[20]选用可以在极性环境中和模板分子形成氢键作用的丙烯酰胺作为功能单体，同时四氢呋喃的极性不足以干扰槲皮素和丙烯酰胺间存在的氢键作用，制备了以槲皮素为模板的MIP，有效地从沙棘粗提物中提取槲皮素和异鼠李素，提示着MIT在中药有效成分分离中所具有的良好前景。谢建春等[21]采用非共价法，在极性溶剂中，以丙烯酰胺作功能单体，以强极性化合物槲皮素为模板，制备了MIP，液相色谱实验表明，MIP对槲皮素具有特异的亲和性，将此MIP直接分离银杏叶提取物水解液，得到的主要是槲皮素及山奈酚黄酮组分，证实了MIT用于直接分离中草药中具有特定药效化合物的可行性。李礼等[22]分别以黄栌的主要成分非瑟酮为印迹分子，丙烯酰胺为功能单体，EDMA为交联剂，通过封管聚合法合成了MIP，将其装于自制的固相萃取柱中，研究了以不同体积比的乙醇-水溶液为溶剂时非瑟酮在柱上的保留行为。通过优化清洗及洗脱条件，使非瑟酮与它的结构相似物槲皮素在柱上得到了很好的分离。有研究小组以骆驼蓬种籽中抗肿瘤活性成分的结构类似物哈尔满为模板分子用非共价键法制备了MIP[23]，并作为液相色谱固定相与大气压电离飞行时间质谱联用，结果表明该MIP对模板分子哈尔满印迹效应最强，其次是三个哈尔满的结构类似物，而对其它几个结构不相似的含氮杂环化合物几乎没有印迹。将骆驼蓬种籽甲醇提取物(主要含哈马灵及哈尔明两种抗肿瘤生物碱)进样后，MIP柱能选择性地保留哈马灵及哈尔明，并通过质谱可以快速地从复杂的骆驼蓬提取液中分离鉴定出哈马灵及哈尔明，实现了中药活性成分分离鉴定的一体化。

3 存在问题与展望

分子印迹技术以其巨大的潜力得到飞速发展，但仍然存在很多问题。首先，如何从分子水平更好的理解分子印迹过程和识别过程，仍需努力。其次，大量的MIP局限于非极性环境中，急需寻求一些适用于水溶液的功能单体。第三，在层析中目标分子与MIP结合位结合慢，引起峰展宽，拖尾而降低分离效率。第四，大多数功能单体只适用于小分子物质，对于生物大分子的印迹技术尚需进一步探索。

总之，随着生物技术、电子技术、合成手段和现代分析检测手段的迅猛发展，MIP的合成、表征方法和理论系统将日臻完善，MIP作为一种高选择性的主体分子，对中药活性物质的特异性分离是其他分离技术所无可比拟的。将该技术应用于中药活性物质的分离，不仅具有深刻的理论意义，而且必将拥有美好的应用前景。

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张雅雯(1985-)，本科，药师。E-mail：86558010@qq.com

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