牡丹皮抗子宫内膜异位症活性部位化学成分研究

张 伟， 王艳华， 吴德玲*， 王 权， 方成武，2， 程 璐

（1.安徽中医药大学药学院， 安徽 合肥 230031； 2.安徽省现代中药重点实验室， 安徽 合肥 230031；3.安徽省中医药科学院药物化学研究所， 安徽 合肥 230031）

［成分分析］

牡丹皮抗子宫内膜异位症活性部位化学成分研究

张 伟1，2，3， 王艳华1， 吴德玲1，2，3*， 王 权1， 方成武1，2， 程 璐1

（1.安徽中医药大学药学院， 安徽 合肥 230031； 2.安徽省现代中药重点实验室， 安徽 合肥 230031；3.安徽省中医药科学院药物化学研究所， 安徽 合肥 230031）

目的 研究牡丹皮抗子宫内膜异位症活性部位的化学成分。方法 运用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱及制备型液相色谱对抗子宫内膜异位症牡丹皮总苷乙酸乙酯的提取物进行分离纯化，根据化合物的理化性质和波谱数据鉴定结构。结果 从牡丹皮抗子宫内膜异位症活性部位中共分离鉴定了 8 个化合物， 分别为丹皮酚 （1）， 苯甲酸 （2）， β-谷甾醇 （3）， 2， 5-二羟基-4-甲基苯乙酮 （4）， 苯甲酰芍药苷 （5）， 芍药新苷 （6）， 芍药苷 （7）， 氧化芍药苷 （8）。 结论 化合物6为首次从该植物中分离得到。

牡丹皮；抗子宫内膜异位症；活性部位；化学成分

牡丹皮为芍药科植物牡丹 Paeonia suffruticosa或凤丹 Paeonia ostii.的干燥根皮［1］， 始载于 《 神农本草经》， 性微寒， 味辛、 苦， 归心、 肝、 肾经， 具有清热凉血， 活血化瘀之功效［2］。 牡丹皮中主要含有酚及酚苷类、单萜及其苷类成分，其他还有三萜、甾醇及其苷类、黄酮、有机酸、香豆素等［3］； 其中丹皮酚、 丹皮总苷、 丹皮多糖等 为其主要 活 性 物 质［4-5］。 现 代 研 究 证 实 牡 丹 皮 具 有 抗菌、抗炎、抗过敏及免疫调节、改善血液流变学等作用，是治疗妇科疾病的常用要药。课题组前期药理研究中［6］发现丹皮不同提取物能明显降低子宫内膜异位症模型动物血清 IL-1、 IL-6 的水平， 减轻炎症反应，其中丹皮酚、丹皮总苷作用最为明显；对血清 IL-1 水平下降排序为丹皮多糖组 ＜桂枝茯苓胶囊组＜丹皮总苷组＜丹皮酚组 ＜丹皮水提物组； 对血清 IL-6 水平下降排序为丹皮多糖组 ＜桂枝茯苓胶囊组＜丹皮总苷组＜丹皮水提物组＜丹皮酚组，桂枝茯苓胶囊组、丹皮水提物组、丹皮酚组、 丹皮总苷组与模型组相比有显著性差异 （P＜0.05）。 为了更好地利用这一药用资源， 因此以抗子宫内膜异位症作用为导向，对牡丹皮中抗子宫内膜异位症的活性部位丹皮总苷进行了化学成分研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器 AV-400 核磁共振仪 （ 德国 Bruker公司）； Dr Flash-S 系列中压制备型液相色谱仪 （ 上海利穗科技有限公司）， 分离柱为 SepaFlash 预装柱； WRS-IB数字熔点仪 （ 上海索光光电技术有限公司， 温度未校正）； CP225D型十万分之一电子天平 （德国赛多利斯）； RE-52A系列旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）； SHB-Ⅲ循环式多用真空泵 （郑州长城科工贸有限公司）； ZF-2 型三用紫外仪 （上海安亭电子仪器厂）。

1.2 材料 柱色谱用硅胶 （100 ～200 目， 200 ～300 目）、 薄层色谱用硅胶 G、 GF254（ 青岛海洋化工厂生产）； 凝胶 Sephadex LH-20 （50 μm， GE公司）；Rp-C18（50 μm， Merck 公司）； 乙醇为食用酒精；水为蒸馏水；其他试剂均为市售分析纯。显色剂为 5%香草醛-硫酸-乙醇溶液， 喷后 105 ℃加热至显色。

药材采自安徽省铜陵市，经安徽中医药大学中药与资源教研室方成武教授鉴定为芍药科植物凤丹Paeonia ostii.的干燥根皮。

2 提取、 分离

牡丹皮药材 7 kg， 按确定的提取、 富集工艺制备丹皮总苷部位［7］， 以乙酸乙酯进行萃取，减压回收溶剂得到乙酸乙酯部位 150 g， 丙酮溶解后拌样， 三氯甲烷-甲 醇 （100 ∶0、 50 ∶1、 30 ∶1、10 ∶1、5 ∶1、 3 ∶1、 1 ∶1） 系统梯度洗脱， 经TLC检识， 合并相同 的流份。 在三氯 甲烷-甲醇（100 ∶0） 部分经过反复硅胶柱色谱及重结晶得到化合物 1 （200 mg）， 在三氯甲烷-甲醇 （50 ∶1）部分经过反复硅胶柱色谱、凝胶 Sephadex LH-20柱色谱得到化合物 2 （15 mg） 和化合物 3 （12 mg）， 在三氯甲烷-甲醇 （30 ∶1） 部分经过反复硅胶柱色谱、 凝胶 Sephadex LH-20 柱色谱得到化合物 4 （11 mg），在三氯甲烷-甲醇 （10 ∶1）部分经过反复硅胶柱色谱， 凝胶 SephadexLH-20 柱色谱，中压制备液相， ODS 反相柱色谱得到化合物 5 （17 mg） 和化合物 6 （9 mg）， 在三氯甲烷-甲醇 （5 ∶1） 部分经过反复硅胶柱色谱，凝胶 Sephadex LH-20 柱色谱，ODS 反相柱色谱得到化合 物 7 （42 mg） 和化合物 8 （18 mg）。

3 结构鉴定

化合物 1： C9H10O3， mp 52 ～53 ℃，白色针状晶体 （三氯甲烷）， 与三氯化铁反应显紫红色。TLC行为与丹皮酚对照品相同， 且 HPLC检测色谱行为与已知对照品丹皮酚相同，确定化合物1为丹皮酚。

化合物 2： C7H6O2， mp 122 ～123 ℃， 白色结晶 （三氯甲烷-甲醇）， 易溶于甲醇、 三氯甲烷-甲醇的混合溶剂等。 TLC行为与苯甲酸对照品相同，且 HPLC检测色谱行为与已知对照品苯甲酸相同，确定化合物2为苯甲酸。

化合物 3： C29H50O， 白色针状晶体 （ 石油醚-乙酸乙酯） 。 Liebermann-Burchard 反 应呈阳性。1HNMR （400 MHz， CDCl3） δ： 5.3 （1H， brs， H-6），3.52 （1H， m， H-3）， 1.25 （3H， s， Me-19）， 1.12（3H， d，Me-21）， 0.84 （3H，t， J=7.5 Hz， Me-29） ， 0.82 （ 3H， d， J=6.7 Hz， Me-26 ）， 0.79（3H， d， J=6.7 Hz， Me-27） 。 化合物 3 数据与文献［8］对照一致， TLC行为与 β-谷甾醇对照品相同， Rf值相同。 样品与对照品混合物的熔点不下降， 确定该化合物结构为 β-谷甾醇。

化合物 4：C9H10O3， 黄色针状结晶 （石油醚-乙酸乙酯），易溶于三氯甲烷、乙酸乙酯、 三氯甲烷-甲醇的混合溶剂等。1H-NMR （400 MHz， CDCl3）δ： 11.84 （1H， s， 2-OH）， 7.10 （1H， s， H-3 ），6.77 （1H， s， H-6）， 4.54 （1H， s， 5-OH）， 2.54（3H， s， Ar-CH3）， 2.19 （3H， s， CH3） 。13C-NMR（100MHz， CDCl3） δ： 203.4 （C=O）， 156.8 （C-2）， 146.0 （ C-5 ）， 135.6 （ C-6 ） ， 120.0 （ C-1 ），117.6 （C-4）， 114.9 （ C-3 ）， 26.6 （C-9 ），16.6（C-8）。 化合物 4 数据与文献［9-10］ 对照一致，确定该化合物结构为 2，5-二羟基-4-甲基苯乙酮。

化合物 5： C30H32O12， mp 148 ～149 ℃，白色粉末 （ 三氯 甲 烷-甲 醇） ， Molish 反 应 呈 阳性。1HNMR （400 MHz， CD3OD） δ： 7.97 （4H， m， H-2″，6″， 2‴， 6‴），7.54 （ 2H， t， H-4′， H-4‴）， 7.41（4H， t， H-3″， 5″， 3‴， 5‴）， 5.31 （1H， s， H-9），4.50 （1H， d， J=8.0 Hz， H-Glc1′）， 2.44 （1H，d，J=4.2 Hz，H-5）， 2.43 （1H，m， H-5）， 2.40（1H， m， H-7β）， 1.77 （1H， d， J=12.8 Hz， H-3β）， 1.64 （ 1H， d， J=4.4 Hz， H-7β） ， 1.61（1H， d，J=6.8，H-3α），1.17 （3H， s，10-H）。13C-NMR （ 100 MHz， CD3OD） δ：168.0 （ C-7″），167.7 （ C-7‴）， 134.6 （ C-4‴）， 134.4 （ C-4″），131.4 （ C-1″）， 131.2 （ C-1‴）， 130.7 （ C-2″），130.7 （ C-6″）， 130.6 （ C-2‴）， 130.6 （ C-6‴），129.7 （C-3″），129.7 （ C-5″）， 129.7 （ C-3‴），129.7 （ C-5‴）， 106.2 （ C-4 ） ， 102.3 （ C-9 ），100.1 （ C-1′）， 89.3 （ C-1 ） ， 87.1 （ C-2 ）， 77.9（ C-5′）， 75.2 （C-3′）， 75.0 （ C-2′），72.1 （ C-6）， 72.0 （C-4′），65.2 （C-6′）， 61.6 （C-8），44. 6 （ C-3）， 43.83 （ C-5 ） ， 23.0 （ C-7 ）， 19.4 （ C-10）。 化合物5 数据与文献［11］对照一致， 确定该化合物结构为苯甲酰芍药苷。

化合物 6：白色粉末 （甲醇）， 5%硫酸香草醛溶 液 显 色 呈 蓝 紫 色， ESI-MS 为 461 （ ［ MH］-）；1H-NMR （ 400 MHz， DMSO-d6） δ： 7.99（2H， d，J=8.0 Hz， H-2″， 6″）， 7.69 （1H， t， J= 8.0 Hz，H-4″）， 7.56 （2H， t， J=8.0 Hz， H-3″，5″）， 4.84 （1H， d， J=4.0 Hz， H-2） ， 4.71 （2H，s）， 4.49 （ 1H， d， J=8.0 Hz， H-Glc1′）， 2.44（1H， m， H-5）， 2.37 （1H， d， J=12.0 Hz， H-3β）， 2.08 （1H， dd， J=4.0 Hz， H-7α）， 1.40（3H， s， 10-H） 。13C-NMR（100 MHz， DMSO-d6） δ：216.6 （C-4）， 165.5 （C-7″）， 133.6 （C-4″）， 129. 2 （C-1″）， 129.1 （ C-2″， 6″），128.9 （C-3″， 5″），102.3 （ C-2 ）， 94.6 （ C-1′），84.7 （ C-1 ）， 79.5（ C-9 ）， 79.0 （ C-3′）， 74.9 （ C-2′）， 72.7 （ C-5′）， 70.5 （ C-4′）， 62.2 （ C-8 ）， 60.7 （ C-6′），54.9 （ C-6 ）， 47.1 （ C-3 ）， 36.8 （C-5 ），30.2（C-7）， 16.1 （C-10）。 以上数据与文献［12-13］ 报道的芍药新苷基本一致，确定该化合物6结构为芍药新苷。

化合物 7： C23H28O11， 白色粉末 （ 三氯甲烷-甲醇）， Molish 反应呈阳性。 TLC行为与已知对照品芍药苷相同， 且经 HPLC检测保留时间与芍药苷对照品相同，确定化合物7为芍药苷。

化合物 8： C23H28O12， 白色粉末 （ 三氯甲烷-甲醇 ）， Molish 反 应 呈 阳 性。1H-NMR （400 MHz，CD3OD） δ： 7.90 （2H， d J=8.0 Hz， H-2″， 6″），6.82 （2H， d， J=8.0 Hz， H-3″， 5″）， 5.38 （1H， s， H-9）， 4.67 （2H， s， H-8） ， 4.51 （1H， d， J= 8.0 Hz， H-Glc1′）， 2.55 （1H， d， J=6.4 Hz， 5-H）， 2.45 （1H， dd，J=4，8 Hz，7-Hα）， 2.17（1H， d，J=12.0 Hz， 3-Hα），1.92 （1H， d， J= 12.4 Hz， 7-Hβ）， 1.79 （1H， d， J=12.4 Hz， 3-Hβ）， 1.34 （3H， s， H-10）。13C-NMR （100 MHz，CD3OD）δ： 168.1 （ C-7″）， 163.8 （ C-4″）， 133.0（ C-2″， 6″），122.1 （ C-1″），116.3 （ C-3″， 5″），106.4 （C-4）， 102.4 （ C-9）， 100.2 （ C-1′）， 89.4（ C-1 ） ， 87.3 （ C-2 ）， 78.1 （ C-5′）， 78.0 （ C-3′）， 75.1 （ C-2′）， 72.4 （C-6 ）， 71.8 （C-4′），62.9 （ C-6′），61.3 （ C-8 ），44.6 （ C-3 ）， 44.0（C-5）， 23.5 （ C-7）， 19.6 （ C-10）。 化合物 8 数据与文献［11］对照一致， 确定该化合物结构为氧化芍药苷。

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Chem ical constituents of anti-endom etriosis active fraction from Moutan Cortex

ZHANGWei1，2，3， WANG Yan-hua1， WU De-ling1，2，3*， WANG Quan1， FANG Cheng-wu1，2，CHENG Lu1
（1.School of Pharmacy， AnhuiUniversity of ChineseMedicine， Hefei230031， China； 2.Anhui Provincial Key Lab of Contemporary Traditional Chinese Medicine， Hefei230031， China； 3.Institute of Pharmaceutical Chemistry， Anhui Academy of Chinese Medicine， Hefei230031， China）

AIM To study the chemical constituents of anti-endometriosis active fraction from Moutan Cortex. M ETHODS Ethyl acetate extracts of total glucosides from Moutan Cortex in treating endometriosis were isolated and purified by using the silica gel， Sephadex LH-20 and preparative liquid chromatographic separation methods，and structurally identified by physico-chemical properties and spectral analysis.RESULTS Eight constituents were obtained from anti-endometriosis active fraction of Moutan Cortex.Their structures were identified as paeonol（1）， benzoic acid （2） ， β-sitosterol（3）， 2，5-dihydroxy-4-methyl acetophenone（4）， benzoylpaeoniflorin （5），lactiflorin （6） ， paeoniflorin （ 7 ） ， oxypaeoniflorin （ 8 ） .CONCLUSION Compound 6 is first isolated from Moutan Cortex.

Moutan Cortex； anti-endometriosis； active fraction； chemical constituents

R284.1

： A

： 1001-1528（2014）01-0119-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.029

2013-02-17

国家支撑计划项目 （2011BAI04B05）； 国家中医药管理局项目 （201107009）； 康缘中医药科技创新基金 （KYCX201002）；安徽中医学院青年科学研究基金 （2012qn019）

张 伟 （1985—）， 男， 助教， 从事中药活性成分及质量标准规范化研究。

*通信作者： 吴德玲 （1973—） ， 男， 教授， 硕士生导师。 Tel： （0551 ） 5169227， E-mail： dlwu7375@sina.com