血清Th17和Treg细胞在银屑病性关节炎患者中的表达及作用机制

张秀英 董砚奉 董汉玉

(淄博市中心医院风湿免疫科，山东 淄博 255000)

银屑病性关节炎不仅损害关节导致残疾，更有皮肤损害的出现，严重影响患者生存质量〔1〕。银屑病性关节炎的发病机制仍不清楚，有学者认为其与遗传、内分泌障碍、代谢障碍及免疫功能损伤等有关〔2〕。已有研究证实，银屑病的发病与效应CD4+T细胞有关。辅助性T细胞(Th17)和调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)分别是CD4+T细胞的新型亚群，有多种关节炎性疾病及自身免疫性疾病与这两种细胞比例失衡有关〔3，4〕。本研究探讨其在银屑病性关节炎发病中的作用机制。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2012年2月至2014年2月于我院风湿免疫科就诊的70例银屑病性关节炎患者，其中男36例，女34例，平均年龄(65.2±1.6)岁，病程0.5～18年。所以患者均符合以下入选标准：(1)根据诊断标准确诊为银屑病性关节炎；(2)近2 w内接受过糖皮质激素或免疫抑制剂等相关药物治疗；(3)不合并心脑血管、肝、肾、内分泌等其他系统性疾病；(4)患者知情同意。对照组30例均来自门诊健康体检者，其中男16人，女14人，平均年龄(64.8±1.6)岁，均无风湿病及其他自身免疫性疾病病史。试验组与对照组的性别构成及年龄分布的差异无统计学意义(P>0.05)，资料均衡可比。

1.2检测方法

1.2.1IL-17和转化生长因子(TGF)-β1检测 采用酶联免疫吸附法(ELISA)进行检测。主要操作步骤按照ELISA试剂盒(Biosource，美国)说明书进行。

1.2.2Th17细胞亚群检测 采集肝素钠抗凝全血进行细胞培养后采用流式细胞仪进行检测。细胞培养的方法为：RPMI1640培养液按1∶1的比例稀释后加入终浓度为50 g/L的PMA、终浓度为1 mg/L的离子霉素及1 ml/L的莫能霉，混匀后在温度为37℃，CO2浓度为50 ml/L培养箱中培养5 h。取50 μl培养后的全血，加入10 μl的PerCp-抗CD3mAb和10 μl的(FITC)-抗CD4mAb，4℃避光孵育30 min后，加入溶血剂NH4Cl 2 ml后离心弃上清液，加入10 ml的Fixation/ Permeabilization穿膜45 min。加入10 μl的PE-抗人白细胞介素(IL)-17A mAb抗体，同型对照加入10 μl的PE-鼠IgG。4℃避光孵育30 min后对IL-17A进行染色，用FACSCanto检测固定后的标本，并采用BDFACSDiva软件分析数据。结果以CD4+IL-17+T细胞在CD3+CD4+T细胞中的比率进行统计。

1.2.3CD4+CD25+Treg细胞亚群检测 取50 μl未经刺激培养的肝素钠抗凝全血加入10 μl的FITC-抗CD4/(APC)-抗CD25二联抗体，4℃避光孵育30 min后用以标记CD4+CD25+T细胞，使用1 ml的Fixation/Permeabilization穿膜45 min。加入10 μl正常鼠血清，4℃封闭15 min加入10 μl的PE-抗人Foxp3mAb，同型对照加入10 μl的PE-鼠IgG2b，4℃孵育30 min后进行染色，用300 μl染色缓冲液重悬，用FACSCanto检测固定后的标本，并采用BDFACSDiva软件分析数据。以Foxp3+CD4+CD25+Treg细胞在CD3+CD4+T细胞中的比率进行统计。

1.3统计学分析 采用SPSS18.0软件分析t及χ2检验。

2 结 果

2.1两组IL-17和TGF-β1水平的比较 试验组IL-17水平〔(423.57±156.0)ng/L〕高于对照组〔(253.50±131.45)ng/L〕(P<0.05),TGF-β1水平〔(177.34±97.13)ng/L〕低于对照组〔(233.95±116.15)ng/L〕(P<0.05)。

2.3两组Th17细胞、Treg细胞数量的比较 试验组Th17细胞数量〔(15.58±1.54)%〕、Th17/Treg比值(2.89±0.43)均高于对照组〔(8.44±1.33)%,(1.71±0.15),P<0.05〕,Treg细胞数量与对照组相近〔(6.13±1.42)% vs (5.85±1.16)%,P>0.05〕。

3 讨 论

银屑病性关节炎是一种主要累及韧带、肌腱、筋膜和关节的自身免疫性炎症性疾病，其发病率虽然较低，但是严重影响患者的生存质量及生存时间，给患者及社会带来严重负担。CD4+T细胞的数量及功能状态与自身免疫性疾病有密切关系，CD4+T细胞有许多亚型如Th1、Th2等，Th17细胞和Treg细胞是CD4+T细胞的两个新亚型，主要用于维持机体正常免疫应答防止自身免疫性疾病的产生，是与Th1、Th2功能完全不同的亚型，已有许多研究者发现Th17细胞和Treg细胞在自身免疫性疾病及恶性肿瘤等疾病的发病机制中有重要作用。

IL-17是Th17细胞作为一种效应T细胞所分泌的，银屑病性关节炎患者这两者水平均高于正常人，本文结果与已有研究结果相近〔1,5〕。提示Th17细胞的高水平表达促使 IL-17分泌增加， IL-17刺激成骨细胞产生前列腺素E2继而刺激成骨细胞产生破骨细胞分化因子，激活核因子-κB，破骨细胞分化因子与破骨细胞前体上的核因子-κB结合，促进成熟破骨细胞的形成与活化〔6〕。且Th17本身表达破骨细胞分化因子与破骨细胞前体上的核因子-κB结合，从而参与银屑病性关节炎症病变及骨质破坏的过程。本发现TGF-β1可能参与了银屑病性关节炎的发病， TGF-β1是调节骨祖细胞分化增殖的内分泌生长因子，与骨组织的形成及修复等关系密切，因此其含量降低易导致骨质疏松的发生，Treg细胞通过抑制性细胞因子TGF-β1水平发挥主动免疫抑制作用〔7～9〕，提示Treg细胞通过调节TGF-β1水平从而与银屑病性关节炎的发病过程有关。

4 参考文献

1陈晋广,赖 维,姜 昱.银屑病性关节炎患者Th17和Treg细胞的变化及意义〔J〕.中国医学科学院学报,2012；34(6):617-20.

2Moon YM,Lee J,Lee SY,etal.Gene associated with retinoid-interferon-induced mortality 19 attenuates murine autoimmune arthritis by regulation of th17 and Treg cells〔J〕.Arthritis Rheumatol,2014；66(3):569-78.

3李 鑫,范洁琳.Th17/Treg细胞在银屑病的发病机制研究进展〔J〕.现代生物医学进展,2012;12(24):4769-72.

4陈 诚,王 佳,李义德,等.免疫性血小板减少症患儿外周血CD4+CD25+调节T细胞和Th17细胞的变化〔J〕.宁夏医科大学学报,2013;35(8):864-7,前插1.

5陈晋广,姜 昱.银屑病性关节炎患者Th17/Treg相关细胞因子的检测〔J〕.中国皮肤性病学杂志,2012;26(11):969-70,976.

6Galati D,De Martino M,Trotta A,etal.Peripheral depletion of NK cells and imbalance of the Treg/Th17 axis in idiopathic pulmonary fibrosis patients〔J〕.Cytokine,2014;66(2):119-26.

7童来根,吴文忠,周志刚,等.再生障碍性贫血外周血Th17和CD4+CD25+Treg细胞表达情况研究〔J〕.中国实验血液学杂志,2013;21(4):974-8.

8Chevalier MF,Petitjean G,Dunyach-Remy C,etal.The Th17/Treg ratio,IL-1RA and sCD14 levels in primary HIV infection predict the T-cell activation set point in the absence of systemic microbial translocation〔J〕.PLoS Pathog,2013,9(6):e1003453.

9Ma Y,Yuan X,Deng L,etal.Imbalanced frequencies of Th17 and Treg cells in acute coronary syndromes are mediated by IL-6-STAT3 signaling〔J〕.PLoS One,2013;8(8):e72804.