大黄素对肾纤维化大鼠肾组织MMP－9表达的影响

李冬梅 刘 巍

（黑龙江省齐齐哈尔医学院第二附属医院，齐齐哈尔 161006）

大黄素对肾纤维化大鼠肾组织MMP－9表达的影响

李冬梅 刘 巍

（黑龙江省齐齐哈尔医学院第二附属医院，齐齐哈尔 161006）

目的 探讨中药大黄素对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中基质金属蛋白酶－9（MMP－9）表达的影响。方法 120只wister大鼠随机分成3组：假手术组、梗阻组及大黄素治疗组。制备单侧输尿管梗阻 （UUO）模型。治疗组在UUO的基础上每天以大黄素40mg/kg灌胃，采用病理及免疫组化的方法动态观察各组大鼠术后1d、3d、7d、14d梗阻侧肾脏组织学变化和MMP－9在梗阻肾小管间质中表达情况。结果 模型组MMP－9的表达先增高后降低，治疗组MMP－9的表达水平高于模型组 （P＜0.05）。结论 中药大黄素可以通过提高MMP－9的表达，促进ECM的降解来发挥其延缓肾间质纤维化进程的作用。

肾间质纤维化；基质金属蛋白酶－9；大黄素；中药提纯

肾间质纤维化 （renal interstitial fibrosis，RIF）是一个进行性的过程，最终导致终末期肾衰竭。细胞外基质 （extracellularmatrix，ECM）积聚是肾脏纤维化的最终途径［1］。基质金属蛋白酶 （MMPs）是调节ECM动态平衡的重要酶类。近来研究指出，MMP－2和MMP－9破坏肾小管基底膜，促进肾小管上皮细胞转分化，导致肾间质纤维化［2］。肾纤维化的早期干预，可以保护残存肾功能，修复损害组织，延缓尿毒症的发生［3］。本实验将探讨中药大黄素对单侧输尿管梗阻模型大鼠肾间质MMP－9表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康雄性wister大鼠120只 （齐齐哈尔医学院实验动物中心提供），体重在180～240g。房间保持通风、安静和恒温，清洗笼具并定期更换垫料。

1.1.2 药物和试剂 兔抗大鼠多克隆抗体 （MMP－9抗体）购自武汉博士德生物工程有限公司；SP免疫组化试剂盒及显色底物DAB均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；大黄素购自中国药检所。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及模型建立 随机分为三个组，即假手术组、梗阻组 （UUO组）及大黄素治疗组，每组均40只大鼠。按参考文献［4］，梗阻组大鼠行左侧输尿管近肾盂段结扎术建立肾纤维化模型；假手术组打开腹腔后仅游离左侧输尿管但不结扎；大黄素治疗组在造模成功，动物清醒1h后给予中药大黄素40mg/kg灌胃，每日一次。分别于术后1天、3天、7天、14天每组处死10只大鼠，左侧肾脏组织用10%中性甲醛固定24小时，经常规梯度酒精脱水，石蜡包埋，3μm切片，用做HE染色和免疫组化检测。免疫组化步骤严格按试剂盒说明书操作。

1.2.2 采用 Meta－Morph/C505BX41医学图像分析系统进行分析 每张切片随机选取10个不重叠肾小管间质高倍视野，棕黄色颗粒沉积区域为阳性染色区，测量棕黄色阳性染色面积占肾小管间质总面积的比值，取平均值。

1.3 统计学方法 用SPSS13.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以 （±s）表示，计数资料采用χ2检验，组间两两比较用LSD检验法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾组织HE染色光镜观察结果 光镜下假手术组各时间点肾小球及肾小管未见异常改变。UUO术后1天即可见远曲小管和集合管略有扩张，肾间质中偶见炎症细胞浸润；术后第3天肾间质轻度水肿，远端小管中度扩张，散在炎细胞浸润及纤维性渗出；术后第7天肾间质水肿和纤维化加重，肾脏髓质充血明显，更多炎细胞浸润，小管上皮细胞胞浆疏松、肿胀；术后第14天则出现广泛性的肾小管萎缩和间质纤维化，小管上皮细胞肿胀及空泡变性明显，大量炎细胞浸润，皮质明显变薄。治疗组各时间点肾间质的改变与UUO组相比有所减轻，但未达到假手术组水平。

2.2 MMP－9免疫组化表达 假手术组可见MMP－9在肾小管间质及肾小球微量表达。UUO术后1天MMP－9在肾小管间质表达仅少量增加，至术后3天表达明显增强，术后7天表达达峰值，随后呈现下降的趋势，直至术后14天本实验结束，模型组与假手术组相比MMP－9阳性面积表达明显增强，差异有显著性 （P＜0.01），提示有统计学意义。大黄素治疗组MMP－9阳性面积表达与模型组比较明显增多，差异显著 （P＜0.01），有统计学意义。统计学数据见表1。

表1 各组大鼠MMP－9阳性表达面积占肾小管间质总面积 （n＝10，±s）

表1 各组大鼠MMP－9阳性表达面积占肾小管间质总面积 （n＝10，±s）

注：＊为与假手术组比较P＜0.05，△为与治疗组比较P＜0.01

组别 术后天数（天）第1天 第3天 第7天 第14天假手术组 0.460±0.042 0.366±0.019 0.440±0.033 0.446±0.039梗阻组 3.276±0.39＊△ 4.103±0.701＊△ 5.517±0.561＊△ 4.071±0.336＊△治疗组 3.693±0.281 4.980±0.539 6.366±0.598 4.592±0.487

3 讨论

肾小管间质纤维化 （RIF）几乎是各种原因所致的肾脏疾病进展到终末期演变为慢性肾功能衰竭的共同病理过程。细胞外基质 （ECM）积聚是RIF主要机制之一，肾间质纤维化与ECM的过度分泌和组织降解ECM的能力异常均有关系［5］，所以当ECM的合成与降解失衡时，会导致ECM在肾间质大量广泛沉积。基质金属蛋白酶及其组织抑制物系统 （MMPs/TIMPs）是调控ECM降解的主要酶系［6］之一。MMPs以无活性的潜酶或酶原形式分泌，在中性p H值下，有内在Zn2＋和外在Ca2＋存在时方可发挥酶的活性，其酶活性可被螯合剂所抑制，也可被金属蛋白酶组织抑制剂 （TIMPs）抑制［7］。因此，调控降解酶系的比例及细胞外基质的含量能够抑制肾小球硬化、肾间质纤维化及肾功能不全［8］。MMP－9是Ⅳ型胶原酶，能降解明胶、基底膜胶原 （Ⅳ型胶原），调节生理和病理状态下ECM的合成和降解平衡。Aresu L等报道MMPs的2种主要亚型MMP－2和MMP－9可以破坏肾小管上皮基底膜的完整，诱导肾小管上皮细胞的迁移及表型转化［9］，进而导致纤维化的发生。本实验中光镜下可见，肾组织病理改变为随梗阻时间延长间质纤维化逐渐加重，与赵春利等［10］报道相一致。免疫组化可见正常肾组织MMP－9在肾小管间质微量表达，UUO术后1天到7天，肾脏MMP－9的表达逐渐增加，与程红新等报道相符［11］，于7天形成高峰，提示UUO大鼠肾组织局部合成MMP－9的活性增加，其降解ECM能力也相应增加，是病变肾组织消除过多的ECM，阻止肾组织纤维化形成的一种自身抑制效应。而MMP－9的表达达到高峰后出现下降，可能是它对基质的降解有所减弱，而本实验中梗阻肾肾间质纤维化并未减轻原因可能为：①MMP－9前体蛋白的激活减少；②病理因素导致ECM合成增多。

大黄素是从大黄生药中分离提纯的有效成分之一，具有抑菌消炎、抗氧化，以及抗肿瘤、调节胃肠活动、抗肝肾纤维化等多种药理作用［12，13］。目前大量的实验研究均表明，中药大黄素治疗肾纤维化的作用值得肯定。秦建华等认为［14］，大黄素抗RIF作用机制体现在：①大黄素对肾脏细胞增殖，凋亡及表型转化的影响；②大黄素抑制促纤维化因子的合成与分化；③大黄素调节ECM合成与降解。本实验中大黄素治疗组肾组织病理学损伤显著减轻，提示大黄素具有抗肾间质纤维化作用。大黄素治疗组MMP－9表达高于梗阻组 （P＜0.01），表明大黄素可能通过增加肾组织中MMP－9的表达，促进ECM的降解，使堆积减少，从而延缓间质纤维化的进展，保护肾脏功能。

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The Effect of Emodin on Expression of Matrix Metalloproteinase－9 in Rat with Renal Tubulointerstitial Fibrosis

Li Dongmei Liu Wei（Second Affiliated Hospital of Qiqihar Medical College，Heilongjiang Province，Qiqihar，161006，China）

ObjectiveTo investigate the dynamic changes of MMP－9 expressions in renal interstitial fibrosis（RIF），and to explore the mechanism of RIF and the effect of emodin.MethodsOne hundred and twenty rats were randomly divided into 3 groups：the sham－operated group，the UUO group and the emodin treated group.Rat in the DTG were administered intragastrically with emodin 40mg/kg daily after modeling.Ten rats of each group were killed respectively at day 1，3，7 and 14 days after UUO.Renal histopathological changes was observed by light microscope.The expression of MMP－9 were examined by HE staining and immunohistochemistry at each time point.ResultsIn UUO rats，the express of MMP－9 firstly increased and then decreased；In DTG group，the express of MMP－9 incrased significantly compared to the same time in the UUO group.ConclusionThe up－regulation of MMP－9 involved in the pathogenesis of tubulointerstitial fibrosis.Emodin may suppress fibrosis development and can protect the function of renal.

renal interstitial fibrosis；MMP－9；emodin；herbal purification

10.3969/j.issn.1672－2779.2014.10.097

1672－2779（2014）－10－0160－02

（本文责编：杨 杰 本文校对：刘兴权

2014－01－16）