云南半细毛羊毛囊干细胞表面标记物的鉴定

李东江，权国波，杨红远，吕春荣，洪琼花

（云南省畜牧兽医科学院，昆明 650224）

遗传育种

云南半细毛羊毛囊干细胞表面标记物的鉴定

李东江，权国波，杨红远，吕春荣，洪琼花

（云南省畜牧兽医科学院，昆明 650224）

设计8对引物（CK14、CK15、CK19、CD34、CD271、CD200、nestin和β1），分别扩增云南半细毛羊成纤维细胞和毛囊干细胞表面标记物。结果表明：在成纤维细胞中CK19和β1表现为阳性，而在毛囊干细胞中CK14、CK19和β1表现为阳性，其他标记物的表达都为阴性。因此，CK14可以作为鉴定云南半细毛羊毛囊干细胞的表面标记物之一。

云南半细毛羊；毛囊干细胞；表面标记物

毛囊为包围在毛发根部的囊状组织，由上皮和真皮两部分组成，是控制毛发生长的皮肤附属器官。毛囊干细胞（hair follicle stem cells,hFSCs）是定位于毛囊隆突区（即皮脂腺开口处与立毛肌毛囊附着处之间的毛囊外根鞘）的一类成体干细胞［1］。毛囊干细胞是毛囊中的原始细胞，其分化经毛囊干细胞、短暂增殖细胞（transit amplifying cells，TAC）和有丝分裂后分化细胞（postmitotic differentiatingcells，PDC）3个阶段，在体内表现为自我更新能力和慢周期性,体外培养时表现出高克隆能力和多分化潜能［2］。毛囊干细胞自我更新能力强,具有多分化潜能,易于获取,是干细胞生物学和组织工程研究的理想模型之一,具有广泛的临床应用前景，是近几年国内外研究的热点。

hFSCs的标记物不仅可以为hFSCs的鉴定提供依据，还是分离获得高纯度hFSCs的前提，同时也是对hFSCs的分子生物学机制进行深入研究的基础［3］。然而，目前关于绵羊毛囊干细胞标志物尚存在争议。本课题组前期已经初步建立了云南半细毛羊毛囊干细胞系，本试验旨在通过检测CK14、CK19和β1等8个基因在毛囊干细胞的表达情况，确定云南半细毛羊毛囊干细胞系的特异性标志物，为后续的hFSC定向分化以及毛囊发育调控机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物

云南半细毛羊由昆明易兴恒畜牧科技有限责任公司种羊场提供；试验用组织块取自成年羊背部皮肤和耳尖。

1.2 试剂和试剂盒

胰蛋白酶和青链霉素溶液（PS）购自Bioind公司；DMEM/F12和B27购自Gibco公司；碱性成纤维细胞生长因子（β-FGF）购自PEPROTECH公司。总RNA提取试剂盒：SV Total RNA Isolation System（Promega，USA）；反转录试剂盒：Reverse Transcription System（Promega，USA）；DNA胶回收试剂盒DNA marker、Taq DNA聚合酶均

购自宝生物工程（大连）有限公司；扩增产物送交上海生工进行测序。其余所有试剂均购自Sigma公司。

1.3 hFSCs系建立

取云南半细毛羊成年羊背部皮肤样本0.5cm×0.5 cm，75%酒精浸泡2 min，然后用生理盐水+1%青链霉素溶液洗3次，用柳叶刀刮去皮肤表面污物。用手术剪和镊子把皮肤剪成0.1 cm×0.1 cm的小块。将皮肤块在缓冲液（DMEM-F12+1%PS）中洗3次。在体视镜下用眼科镊子将毛囊从皮肤拔出。将拔出的毛囊收集到一起，在缓冲液中洗涤3次后，移入12孔板中，每孔4～6根，加入0.5 mL培养液。最后将毛囊组织放入培养箱（37℃，5% CO2，饱和湿度）中培养。培养液组成：DMEM-F12+bFGF 40ng/mL+EGF20ng/mL+B2720μL/mL+1%PS。

1.4 成纤维细胞系建立

从消毒去毛后的云南半细毛羊耳尖剪取0.5 cm2大小的皮块，置于4℃保存液中，在2 h内带回实验室进行培养。保存液为DMEM＋10%FBS＋200 IU/mL青霉素＋200 IU/mL链霉素。在无菌条件下，将组织块用生理盐水液反复洗涤3次，然后用眼科剪剪成碎块，置于直径50 mm的培养皿中，每皿10块进行培养。所用培养液为DMEM添加10%FBS，在5%CO2、饱和湿度和37.0℃培养箱中进行培养，细胞长出后开始换液，之后每3天换液1次。待培养皿基本铺满单层细胞，去除培养液添加胰蛋白酶-EDTA（TE）消化液控时控温消化。在成纤维细胞离壁前添加含有血清的培养液终止消化，制成细胞悬液，再移至离心管中，经1 600 r/min离心5 min后弃上清，按照传代前与传代后1∶2的细胞数目比例对细胞进行传代培养，每隔24 h进行换液。等细胞汇合度达到80%～90%时，进行下一次传代。原皿中贴壁较紧的细胞，可换液继续培养。

1.5 引物设计与合成

根据GenBank中绵羊CK14、CK19、CK15、CD34、CD271、CD200、nestin和β1基因mRNA序列，设计8对基因的引物。引物序列见表1，由上海生工合成。

表1 引物序列及其扩增片段

1.6 基因扩增

1.6.1RNA提取 将培养细胞的培养瓶取出，用PBS洗涤细胞2次，加入1 mL的胰酶溶液，晃动容器使胰酶分布均匀，待到细胞松动，尽快除去胰酶溶液，用PBS冲洗细胞，把细胞收集到无菌离心管中，500×g离心5 min，弃上清。向细胞沉淀中加入175 μLRNA裂解液，混合均匀。然后取175 μL裂解物加入350 μL DNA Dilution Buffer，颠倒试管3～4次，在70℃水浴中孵育3 min。在20～25℃,12 000 g离心10 min。用移液枪将上清液移到一无菌离心管中，向上清液中加入200 μL95%乙醇，用移液枪吸放3～4次以混合。将此混合物转移到离心柱装配体中，12 000 g离心1 min。从离心柱装配体上拿下离心柱，弃去收集管中的液体，加600 μLRNAWash Solution于离心柱装配体，12 000 g离心1 min。清空收集管，向装配体中加入50 μL的DNase孵育混合物，轻轻吸放均匀。于20～25℃孵育15 min，然后向离心柱中加入200 μL DNase Stop Solution，12 000 g离心1 min，再加入600 μL RNAWash Solution，高速离心2 min。取出一个1.5 mL带盖洗脱管，将离心柱从收集管上转移到洗脱管中，向膜上加100 μL无核酸酶水，12 000 g离心1 min，丢弃离心

柱，盖好盛有RNA的洗脱管，保存于-70℃冰箱。

1.6.2 反转录 按反转录试剂盒Reverse Transcription System的说明进行操作。在试验前，先将1 μg的RNA加入微量离心管中，并于70℃温育10 min，短暂离心后置于冰上。反转录体系：MgCl2（25 mM）4 μL，反转录10×缓冲液2 μL，dNTP混合液2 μL，重组RNasin 0.5 μL，AWV反转录酶1.5 μL，OligodT引物1 μL，RNA5 μL，无RNA酶蒸馏水4μL。反转录反应条件：42℃15min；95℃5 min；4℃5 min。cDNA于-20℃下备用。

1.6.3PCR扩增 PCR反应体系：cDNA 2 μL，dNTP 2 μL，10×缓冲液（已加MgCl2）2.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Taq酶0.5 μL，灭菌蒸馏水16 μL。PCR反应条件：94℃预变性2 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃80 s，共25个循环；4℃保存。反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2 结果与分析

各标志物基因的表达电泳分析情况见图1和表2。可以看出，用毛囊干细胞来扩增表面标记物，CK14、CK19和β1为阳性，其他都为阴性。而用成纤维细胞来扩增表面标记物，只有CK19和β1为阳性，其他都为阴性。对比可以看出，在所选择的8个表面标记物中，CK14可以作为从分子水平上区别毛囊干细胞和体细胞的特异性标志物。

图1 扩增毛囊干细胞和成纤维细胞表面标记物电泳图

表2 毛囊干细胞与成纤维细胞RT-PCR鉴定结果

3 讨论

毛囊干细胞的标志物比较复杂，物种、存在部位，甚至细胞分离技术的不同而有差异［4］。整合素是介导胞外基质黏连、调节分化的重要因子。Jones等［5］的研究提示,整合素β1是表皮干细胞的标志之一，但Tumbar［6］的研究则发现β1在某些不具有干细胞特性的细胞中也能高表达。本试验的结果证实了Tumbar［6］的观点，发现整合素β1在云南半细毛羊的毛囊干细胞和成纤维细胞中都有表达。角蛋白是表皮细胞的结构蛋白,可用于鉴别表皮干细胞、暂时增殖细胞和终末分化细胞。表皮干细胞表达CK19，暂时增殖细胞（TA细胞）表达CK5和CK14，而终末分化细胞主要表达CK1和CK10。本试验发现在毛囊干细胞中CK14和CK19都为阳性，在对照组成纤维细胞中CK19为阳性，而CK14为阴性，这与徐红［7］对人成纤维细胞和毛囊干细胞标志物的研究结果一致。上述结果可能是因CK19和波形蛋白（vimentin）具有同源性，RT-PCR鉴定时CK19基因出现假阳性所致。但CK14却特异性地在毛囊干细胞中表达，所以可以选用CK14作为标志物来分选云南半细毛羊毛囊干细胞和成纤维细胞。造血干细胞标志物CD34也是公认的毛囊干细胞。CD34是鼠毛囊干细胞的标志物，但Ohyama等［8］提示CD34不能用来分离人毛囊干细胞。本试验结果进一步证实CD34也不能用来分离云南半细毛羊毛囊干细胞。

本试验首次对云南半细毛羊毛囊干细胞表面标志物表达情况进行了初步分析，同时以皮肤来源的成纤维细胞作为对照。结果表明，CK14在绵羊毛囊干细胞中特异性表达，可作为毛囊干细胞分选的标志物。

［1］WatersJM，RichardsonGD，JahodaCA.Hairfolliclestemcells［J］.Semin Cell DevBiol，2007，18（2）：245-254.

［2］Tiedes，Kloepper J E，Bodò E，et al.Hair follicle stemcells:walkingthe maze［J］.Eur J Cell Biol，2007，86（7）：355-376.

［3］倪振洪，邵勇，李玉红.毛囊干细胞标记物的研究进展［J］.中国细胞生物学学报，2010，32（1）：43-48.

［4］李睿书，王石泉.毛囊干细胞［J］.细胞生物学杂志，2007，29：457-462.

［5］JonesPH，WattFM.Separationofhumanepidermalstemcellsfromtransit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression［J］.Cell，1993，73:713-724.

［6］TumbarT.Definingtheepithelialstemcellnicheinskin［J］.Science，2004，303：359-363.

［7］徐红.毛囊干细胞的分离培养与鉴定［D］.长春：吉林大学，2009.

［8］Manabu Ohyama，Atsushi Terunuma，Christine L，et al.Characterization and isolation ofstemcell-enriched human hair follicle bulge cells［J］.Clin Invest，2006，116:249-260.

Identification of Hair Follicle Stem Cell Surface Markers From Yunnan Semi-wool Sheep

Li Dong-jiang，Quan Guo-bo，HongQiong-hua，et al
（Yunnan AcademyofAnimal and VeterinarySciences，Kunming650224，China）

Eight paris of primers（CK14，CK15，CK19，CD34，CD271，CD200，nestin and β1）were designed to amplify surface markers of hair follicle stem cells and fibroblast cells from Yunnan semi-wool sheep，the results showed that CK19 and β1 performed positive in fibroblast cells，CK14，CK19 and β1 performed positive in hair follicle stem cells，the expression ofother markers were negative，soCK14 could be used as one ofthe surface markers toidentifyfollicle stemcells ofYunnan semi-wool sheep.

Yunnan semi-wool sheep；hair follicle stemcell；surface marker

S826.2

A

2095-3887（2014）01-0005-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.01.001

2013-10-31

国家现代农业产业技术体系建设（CARS-40）；云南省应用基础研究青年项目（2012FD083）

李东江（1982-），男，助理研究员。

洪琼花，研究员，硕士生导师。