牦牛FASN基因多态性及其与肉质性状的相关性研究

褚 敏，焦 斐，吴晓云，阎 萍，梁春年，郭 宪，裴 杰，丁学智，包鹏甲，朱新书

（1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，兰州 730050；2.甘肃省牦牛繁育工程重点实验室，兰州 730050）

牦牛FASN基因多态性及其与肉质性状的相关性研究

褚 敏1，2，焦 斐1，2，吴晓云1，2，阎 萍1，2，梁春年1，2，郭 宪1，2，裴 杰1，2，丁学智1，2，包鹏甲1，2，朱新书1，2

（1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，兰州 730050；2.甘肃省牦牛繁育工程重点实验室，兰州 730050）

利用PCR-SSCP技术，对甘南牦牛、大通牦牛和天祝白牦牛的FASN基因第3内含子进行SNPs筛选，并将筛选到的突变位点与牦牛部分肉质性状进行相关性分析。结果发现，3个牦牛群体在第3内含子检测到g.5477 C→T的突变，由此产生3种基因型：HH、HG、GG。相关性分析表明，HH基因型和HG基因型个体的脂肪含量显著高于GG基因型个体（P<0.05）。HH、HG、GG 3种基因型对失水率、熟肉率、pH24值和剪切力的影响差异不显著（P>0.05）。

牦牛；FASN基因；SNPs；肉质性状

脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FASN）是脂肪酸合成代谢的关键酶。动物体脂沉积所需要的脂肪酸大多来自脂肪酸从头合成，而脂肪酸的合成需要FASN催化乙酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A和NADPH来实现［1-2］。FASN基因是体脂沉积性状和肉质性状的重要候选基因［3-4］。近年来，国内外研究者对脂肪酸生物合成途径进行了大量研究，初步阐明了脂肪酸合成的规律，尤其是对脂肪酸合成酶基因的表达进行了探索性的研究［5］。相关研究表明，脂肪酸合成酶在哺乳动物肝脏和脂肪组织中表达［6］。脂肪酸合成酶基因（FASN）也已在一些动物中完成定位，人FASN基因定位于染色体17q25，鼠的定位于11号染色体，鸡的定位于18号染色体，牛的定位于染色体19q22［4］。Chris等［7］通过连锁分析对牛19号染色体上的QTL进行了鉴定，认为FASN是这个QTL的候选基因，并检测到了5个SNPs，通过相关分析结果表明：FASN基因的SNPs与脂肪和乳脂相关。RoyR等（2006）研究表明牛 FASN基因有多个 SNPs，其中Exon1g. 763G/C和Exon34g.16009 A/G突变改变了一个潜在的

SP1转录因子的结合位点，导致了苏氨酸转变为丙氨酸，基因单倍型研究发现这些SNPs之间存在连锁不平衡（P<0.01），并且认为FASN基因是乳脂含量QTL的一个候选基因［5］。

牦牛广泛分布于青藏高原及其周边地带，为当地提供肉、乳、毛、皮等产品。牦牛肉肉质鲜美，具有高蛋白、低脂肪、低热量的特点，又因其生产于无现代工业污染的高寒草原，是地道的“绿色食品”，近年来深受消费者青睐［8］。随着分子遗传学的迅速发展和动物遗传改良技术的不断完善，在动物遗传标记辅助选择中，遗传标记技术得到了广泛应用［9］。因此，利用生物学遗传标记技术进行优质牦牛的育种具有十分重要的意义。

本研究利用PCR-SSCP技术首次对中国3个牦牛群体脂肪酸合成酶基因进行SNPs检测，并将发现的SNPs与牦牛部分肉质性状进行关联性分析，旨在寻找与牦牛肉质性状相关的遗传标记，为牦牛分子育种提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样本采集 试验共采集成年牦牛血样341份，其中甘南牦牛98头份、天祝白牦牛137头份、大通牦牛106头份，经颈静脉采血5 mL，ACD抗凝，4℃运输，带回实验室后-70℃低温保存。

1.1.2 试剂 TaqDNA polymerase、TaqPCR MasterMix、蛋白酶K、琼脂糖、溴化乙锭、Tris饱和酚、DNAMarker均购自天根生化科技（北京）有限公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 基因组DNA的提取

牦牛血样基因组DNA的提取采用常规的酚-氯仿抽提法，提取后的DNA用TE缓冲液溶解后，采用2%琼脂糖凝胶电泳检测并用紫外分光光度计测定浓度，-70℃保存。

1.3 引物设计与合成

参照普通牛FASN基因全序列（GenBank登录号AF285607.2）用Primer 5.0设计引物扩增牦牛FASN基因相应区域（表1，只列出具有多态性的引物），引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 牦牛FASN基因PCR扩增的引物序列、目的片段长度及退火温度

1.4 PCR扩增反应条件

PCR反应体系为15μL，含5.7μL高压灭菌水，7.5μL TaqPCR MasterMix，上下游引物各0.3 μL，TaqDNApolymerase 0.2 μL，模板DNA 1 μL；PCR反应程序：94℃5 min；94℃60 s；退火温度30 s（温度见表1）；72℃50 s，共35个循环；72℃10 min；4℃保存。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 PCR产物SSCP分析与测序

将4 μL PCR产物加入8 μL变性上样缓冲液（98%去离子甲酰胺、0.01 mol/L EDTA、0.25%二甲苯氰FF、0.025%溴酚蓝）中，98℃变性10 min，迅速冰浴10 min。加载于预制的10%聚丙烯酰胺凝胶中，以250 V电压电泳10 min，再以200 V电压电泳1.5 h。电泳结束后，进行银染显带并记录结果。经SSCP分析后，将不同基因型的PCR产物进行回收、检测后送上海生工生物工程公司进行测序。

1.6 统计分析

利用SPSS软件检验各基因座位的基因型频率和基因频率。以广义线性模型分析各基因座位和相关性状间的关联性，数学模型如下:

Yijk=μ+si+nj+mk+eijk

式中，Yijk：性状测量值；μ：群体均值；si：性别效应；nj：基因型效应；mk：品种效应；eijk：随机残差效应。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增产物检测及SSCP分型

所得PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，得到355 bp一条特异性目的条带（图1）。由图1可见，扩增效果较好，可用于SSCP分析。将扩增产物经SSCP检测，结果表明，F3B扩增片段检测到3种基因型，分别命名为HH、HG、GG（图2）。

图1 扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2 扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果

2.2 测序结果

将测序结果与GenBank中公布的普通牛FASN基因序列（AF285607.2）比对发现，第3内含子检测到g.5477C→T的突变，测序结果见图3。

图3 FASN基因内含子3测序图

2.3 FASN基因内含子3的基因频率和基因型频率

甘南牦牛、天祝白牦牛、大通牦牛3个群体FASN基因F3B位点的基因型频率和等位基因频率统计结果见表2。结果表明，在F3B位点处3个群体均表现出HG为优势基因型，HH型其次，GG型最弱，H等位基因是优势基因。在F3B位点甘南牦牛处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05），天祝白牦牛、大通牦牛处于不平衡状态（P<0.05），3个牦牛群体在F3B位点均处于中度多态。

表2 3个群体FASN基因内含子3的基因频率和基因型频率

2.4 牦牛FASN基因多态性与肉质性状相关性

将F3B位点的3种基因型与肉质性状进行相关性分析，结果见表3。HH基因型和HG基因型个体的脂肪含量显著高于GG基因型个体（P<0.05）。HH、HG、GG3种基因型对失水率、熟肉率、pH24值和剪切力的影响差异不显著（P>0.05）。

表3 牦牛FASN基因不同基因型与肉质性状最小二乘分析

3 讨论

FASN基因是影响动物体脂沉积性状和肉质性状的重要候选基因。目前对该基因的研究多集中在多态性对牛肉、牛乳脂肪酸的影响，对牛肉脂肪及食用品质影响的研究少见报道。Tsuyoshi Abe等［10］在日本黑牛FASN基因编码区发现 8个 SNPs，其中 g.16024A>G和g.16039T>C两个突变与C18∶0、C18∶1、C14∶0、C14∶1、C16∶0和 C16∶1的含量存在相关性。Chris等［7］在牛FASN基因中检测到了5个多态位点，SNPs与3个牛群体的脂肪和乳脂性状存在一定的相关性。侯玉洁等［11］在中国荷斯坦牛FASN基因第34外显子发现一个g.16009 A/G的突变，该位点突变对短链脂肪酸相对含量有显著影响，AA和AB基因型个体的短链脂肪酸相对含量显著高于BB型。但至今未在牦牛中有任何关于该基因多态性的报道。

通过本次研究，在甘南牦牛、天祝白牦牛和大通牦牛FASN基因的第3内含子检测到g.5477 C→T的突变，发现该突变与牦牛肉脂肪含量存在显著相关性。Dongyep Oh等（2011）在对韩国牛的FASN基因多态性研究中发现g.16907 T→C突变与牛肉脂肪酸含量和大理石花纹有显著相关性。在本研究中牦牛该位点并未发现突变，这可能由种间差异所造成。相关性分析表明，该突变与牦牛肉pH24值和脂肪含量有显著相关性。预测这个突变有可能作为牦牛肉质改良的遗传标记位点。

肉质性状的相关性分析表明，HH基因型和HG基因型个体的脂肪含量显著高于GG基因型个体（P<0.05），由此看出，牦牛群体中H等位基因对牦牛肉脂肪含量起正面效应，HH、HG基因型个体在群体中表现为优势基因型，这可能是由于牦牛群体在长期的人工选育过程中造成的。

本研究发现甘南牦牛在F3B位点处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05），天祝白牦牛、大通牦牛处于不平衡状态（P<0.05），主要原因可能是天祝白牦牛和大通牦牛受人工选择育种的强度较大，牦牛群体在繁育过程中，由于公牦牛间的“优胜序列”，打破了交配的随机性，可能也是造成该基因座处于不平衡的原因。

本次研究结果结合Tsuyoshi Abe等［10］、Dongyep Oh等［12］的研究可推断FASN基因不仅影响牛肉的脂肪酸组成及含量，亦影响牦牛肉的脂肪含量及食用品质相关性状。推测FASN基因可作为牦牛肉质性状标记辅助选择的有效分子标记，对内含子3突变位点的相关性分析为进一步开展牦牛肉质性状分子育种提供了基础数据，并为科研工作者的研究提供了一定的理论基础。

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［11］侯玉洁，常玲玲，冒海赟.中国荷斯坦牛FASN基因单核苷酸多态性对脂肪酸含量的影响［J］.中国奶牛，2011（18）:1-4.

［12］DongyepOh，YoonseokLee，BoomiLa，etal.Fattyacidcompositionofbeef is associated with exonic nucleotide variants of the gene encoding FASN［J］.Molecular BiologyReports，2011，20（7）：111-118.

Association between Polymorphism of FASN Gene and Meat Quality Traits in Yak

Chu Min1，2，JiaoFei1，2，Yan Ping1，2，et al
（1.Lanzhou Institute ofHusbandryand Pharmaceutical Sciences ofCAAS，Lanzhou 730050，China；2.KeyLaboratoryofYak BreedingEngineering，Lanzhou 730050，China）

The polymorphisms on complete intron 3 of FASN gene were detected in three yak breeds including Gannan yak，Datongyak and Tianzhu White yak byPCR-SSCP，and the association between the polymorphisms and meat qualitytraits were analyzed.One polymorphism C→T in 5 477 bp was found.Three genotypes named HH，HG and GG were caused by this mutation. Correlation analysis showed that yaks with HH genotype and HGgenotype had significantlyhigher fattycontent than the GGgenotype（P<0.05）.There were nosignificant difference amongthree genotypes on water loss，cooked meat percentage，pH24and shear force（P>0.05）.

yak；FASN gene；SNPs；meat qualitytraits

S823.8+5

A

2095-3887（2014）01-0017-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.01.004

2013-11-25

国家肉牛牦牛产业技术体系（CARS-382）；公益行业农业科技专项（201003061）；甘南牦牛藏羊良种繁育基地建设及健康养殖技术集成示范（1102NKDA027）

褚敏（1982-），女，助理研究员，硕士。

阎萍（1963-），研究员，博士，博士生导师，主要从事牦牛遗传育种与繁殖研究。