种子芥酸和硫苷含量对甘蓝型油菜遗传转化的影响

，*

（1湖南农业大学农学院，长沙410128；2湖南农业大学生物科学与技术学院，长沙410128）

种子芥酸和硫苷含量对甘蓝型油菜遗传转化的影响

魏解冰1，肖文娟2，刘春林1，2*

（1湖南农业大学农学院，长沙410128；2湖南农业大学生物科学与技术学院，长沙410128）

选取低硫苷低芥酸含量的甘蓝型油菜品种“湘油15号”和“Westar”，高硫苷高芥酸含量的甘蓝型油菜品系“GX-272”和“GX29”，利用农杆菌介导法，以pFGC5941为目标载体，分别对其进行遗传转化。以磷化麦黄酮（PPT）作为筛选剂，分别对4个油菜品种（系）的子叶柄分化率和转化率进行统计。结果表明，双低油菜“湘油15号”、“Westar”的子叶柄分化率高于高硫苷高芥酸油菜“GX-272”和“GX29”；而高硫苷高芥酸油菜“GX-272”和“GX29”的转化率则高于双低油菜“湘油15号”、“Westar”。初步认为种子中硫苷和芥酸含量对甘蓝型油菜子叶柄遗传转化的分化率和转化率有一定影响。

甘蓝型油菜；硫苷；芥酸；遗传转化

油菜是我国最重要的油料作物之一，菜籽油是目前全球仅次于大豆油和棕榈油的第三大植物油。而甘蓝型油菜是3种油用油菜中产油量最高的品种。针对甘蓝型油菜进行的基因工程研究目前已广泛开展。然而，当前以甘蓝型油菜作为受体的遗传转化工作的转化效率较低，一直无法达到商业化的标准和目的，严重制约了转基因油菜的发展。为了解决这一问题，育种工作者们进行了多方面的实验。王艳等［1］发现，甘蓝型油菜子叶柄在诱导分化前经过含有2，4-D的MS培养基中预培养，再转移至含有适量6-BA、NAA和AgNO3的培养基中培养，可较大程度地提高植株再生频率。王景雪等［2］发现，在农杆菌介导的油菜下胚轴转化中，在农杆菌侵染前进行外植体预培养，农杆菌的浸染浓度为OD600＝0.2～0.4，共培养培养基的pH值为5.2时，转化效率较高。刘晓庆等［3］发现，7 d苗龄的甘蓝型油菜下胚轴再生频率为35.83%，经3 d预培养处理的甘蓝型油菜下胚轴再生频率可提高至57.78%。这些实验证明，甘蓝型油菜遗传转化的转化效率还有进一步提高的空间。

尽管前人在甘蓝型油菜遗传转化的具体方法如共培时间、苗龄、激素含量等方面做了许多研究，也取得了大量成果，但甘蓝型油菜种子自身代谢产物含量对遗传转化效率的影响研究却未见报道。本实验室在之前的研究中注意到，种子芥酸和硫苷含量似乎对油菜分化和转化率有影响，但未进行系统研究。本研究以此现象为基础，选取“湘油15号”和“Westar”两种基因型材料作为双低甘蓝型油菜的代表，选取“GX-272”和“GX-29”两种基因型材料作为“双高”甘蓝型油菜的代表，以pFGC5941载体上的bar基因作为目标基因，子叶柄作为外植体，利用农杆菌介导法进行甘蓝型油菜遗传转化，并分别对分化率和转化率进行统计，以探究甘蓝型油菜种子内自身代谢产物硫苷和芥酸对甘蓝型油菜遗传转化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

甘蓝型油菜品种（品系）湘油15号（芥酸含量0.21%，硫苷含量38.5μmol／g）、Westar（芥酸含量0.11%，硫苷含量33.1μmol／g）、GX-272（芥酸含量30.78%，硫苷含量59.62μmol／g）和GX-29（芥酸含量19.96%，硫苷含量98.79μmol／g），由植物代谢调控与代谢工程实验室提供。

1.1.2 菌株与载体

大肠杆菌菌株DH5α、农杆菌菌株LBA4404为湖南农业大学植物代谢调控研究组保存菌株，载体pFGC5941由湖南农业大学植物代谢调控研究组提供。

1.1.3 分子生物学试剂

质粒DNA小量纯化Kit购自OMEGA公司；DNA Marker购自北京天根；CTAB、Tris base、EDTA均购自欧迈生物；琼脂糖为西班牙产；酵母提取物、蛋白胨购自OXOID.LTD；抗生素购自北京鼎国生物技术发展中心；引物订购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验设计

实验共转化4个品种（系）的甘蓝型油菜。每个品种（系）转化4个批次；每批次转化子叶柄外植体约300个，每个品种（品系）共转化约1 200个子叶柄外植体。

1.2.2 外植体的准备

ADRB2、GLCCI1、FCER2基因检测在2例难治性哮喘患儿个体化用药中的实践 ………………………… 任丹阳等（5）：659

选取饱满的甘蓝型油菜种子，经75%酒精浸泡30 s，0.1%HgCl2消毒20 min后均匀的铺在1／2 MS培养基上，暗室培养5 d后取出，光照5 h使子叶变绿。沿生长点以上切下备用。

1.2.3 转化工作液的准备

取保存的带有pFGC5941的LBA4404于含Kan、Str和Rif 3种抗生素的YEB固体培养基上平板划线培养约48 h；挑取单菌落接种于已加入Kan、Str和Rif 3种抗生素的10 mL YEB液体培养基中，28℃，250 rpm，振荡培养36～40 h后吸取约5 mL左右菌液于50 m L YEB液体培养基中，扩大培养至OD600达到1.0；将菌液倒入50 mL离心管中，6 000 rpm，10 min，弃上清；加入约20 mL BM液、9μL的β -巯基乙醇和18μL的乙酰丁香酮后，轻微震荡使其混匀后倒入已灭菌的平皿中备用。

1.2.4 子叶柄的浸染转化

将外植体浸泡于已准备好的转化工作液中静置8 min，取出充分沥干后铺于共培培养基上，22℃暗培养约40 h。

1.2.5 外植体与抗性苗的培养

将22℃暗培养约40 h后的外植体转入含0.3%的磷化麦黄酮（PPT）和500 mg／m L头孢霉素的MB筛选培养基［4］上光照培养，每10 d继代1次。待子叶柄分化出不定苗后将不定苗切下，转入含0.2%PPT的1／2MS培养基中生根培养。

1.2.6 炼苗与转化子筛选

待不定苗生根后即转入盛有蛭石的小钵中炼苗培养。待幼苗长出新叶后，取少量叶片提取DNA，利用以下引物进行PCR检测：

Bar gene-FP：5′-ATGAGCCCAGAACGACGCC-3′

Bar gene-RP：5′-TCAGATTTCGGTCACGGGCA-3′

2×Tag MasterMix聚合酶PCR扩增的反应体系为20μL，反应条件：94℃预变性4 min；94℃变性40 s；68℃退火15 s；72℃延伸40 s；72℃延伸7 min；16℃保存。扩增35个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测为阳性的植株即为转化子。

待转化子植株生长至现蕾期，取少量茎生叶提取DNA，利用相同引物、同样的反应体系再检测一次，检测为阳性的植株即为稳定转化子。

2 结果与分析

2.1 子叶柄分化率

待外植体所形成的愈伤组织再分化成为幼苗时，分别统计4个甘蓝型油菜的外植体（子叶柄）数量和由外植体分化产生的幼苗数量，并计算每种油菜的分化率。双低油菜“湘油15号”和“Westar”的分化率均在10%以上，而“GX-29”和“GX-272”的分化率分别只有3.23%和2.54%（表1）。这个结果表明，双低油菜比双高油菜更容易分化，使用双低油菜更容易分化出抗性苗。

表1 4个油菜品种（系）的子叶柄分化率

2.2 子叶柄转化率

图1 抗性苗PCR检测结果

利用上述的Bar gene-FP／RP引物，在幼苗生长初期先取少量新叶提取DNA，进行PCR检测（图1）。待幼苗生长至现蕾期，再取少量茎生叶提取DNA，进行PCR扩增后，即可检测出稳定遗传转化子（图2）。分别统计4个甘蓝型油菜品种（系）分化幼苗中转化子的数量和稳定遗传转化子的数量，并计算每种油菜的转化率和稳定遗传转化率，结果于表2。双低油菜的转化率与稳定遗传转化率分别只有0.216%和0.041%；而2个双高油菜的转化率和稳定遗传转化率则达到了0.454%和0.191%。很明显，“GX-272”和“GX-29”首次检测的转化率和稳定遗传转化率都远高于双低甘蓝型油菜；特别是在稳定遗传转化率上，“GX-272”和“GX-29”平均高出双低甘蓝型油菜4倍有余。

图2 茎生叶PCR检测结果

表2 4个油菜品种（系）的子叶柄转化率

3 讨论

甘蓝型油菜是由芸薹与甘蓝通过自然种间杂交后加倍进化而来的一种异源四倍体，是我国长江中下游地区最重要的植物油来源之一。多年来，分子育种工作者一直探寻提高甘蓝型油菜遗传转化率的途径，但多数都是以改变如共培时间、共培培养基pH值、激素含量等外部实验条件作为基础进行研究，极少探究甘蓝型油菜种子自身可能对遗传转化工作产生的影响。

本研究发现，不仅外界条件可以对分化率和转化率产生影响，作为种子自身的代谢产物，硫苷和芥酸对分化率和转化率也能产生十分明显的影响。如“GX-272”和“GX-29”的转化率就高于双低甘蓝型油菜数倍；而双低甘蓝型油菜的分化率又远高于“GX-272”和“GX-29”。这个结果有力的证明了种子自身的代谢产物对甘蓝型油菜的遗传转化也起着至关重要的作用。

在甘蓝型油菜遗传转化工作中，另一个十分重要的问题就是转化子的转基因稳定性。研究中发现，在转化子成苗初期的检测中，能够检测出大量的转基因植株，在“GX-272”和“GX-29”中可达到近0.5%；而随着早期检测到的转化子的生长和发育，有的转化子后来生长出的叶片中就检测不到目标基因的存在，因此很难得到稳定的转基因植株。这可能和转化子顶端分生组织的嵌合状态有关：在转基因植株转到土中生长后，由于没有除草剂的选择压力，生长点的非转基因细胞可能会因为生长较快而将转基因细胞替换掉，导致后期生长点中完全由非转基因细胞组成。根据目前已完成的实验结果，如果能够在某一株转基因植株的茎生叶中检测出阳性条带，那么这一株转基因植株的T1代也能够检测出转基因植株，而如果只能在幼苗初期检测到阳性条带的转化子，T1代不一定能检测出转基因植株。所以，笔者建议在甘蓝型油菜的遗传转化工作过程中，以茎生叶的PCR检测结果来判断是否为可稳定遗传的转基因植株较为可靠。

［1］ 王 艳，贺 斌，曾幼玲，等.甘蓝型油菜带柄子叶高频率再生植株的研究［J］.中国油料作物学报，2004，26（4）：86-90.

［2］ 刘晓庆，沈 源，蔡小宁，等.甘蓝型油菜下胚轴立体培养再生植株研究［J］.安徽农业科学，2008，36（31）：13547-13548.

［3］ 孙 洁，黄 团，李加纳，等.农杆菌培养方式和预培养基激素配比对甘蓝型油菜下胚轴转化效应分析［J］.西南大学学报：自然科学版，2007，29（12）：49-53.

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［7］ Ujjal KN，Jeroen A.Increasing erucic acid content through combination of endogenous low polyunsaturated fatty acids alleleswith Ld-LPAAT＋Bn-fae1 transgenes in rapeseed（Brassica napus L.）［J］.Theoretical and Applied Genetics，2009，118：765-773.

［8］ 潘 刚，周永明.甘蓝型油菜遗传转化的研究进展［J］.中国油料作物学报，2003，25（3）：90-98.

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［10］陈锦清，黄锐之.油料作物基因工程育种［J］.中国生物工程杂志，2004，24（5）：24-29.

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Effects of Erucic Acid and Glucosinolate Content in Seeds on Genetic Transformation in Brassica napus L.

WEIJie-bing1，XIAO Wen-juan2，LIU Chun-lin1，2*

（1 College of Agronomy，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China；2 College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

In this study，the lower glucosinolate and lower erucic acid content varieties of Brassica napus L.Xiangyou 15 and Westar，higher glucosinolate and higher erucic acid content strainsof Brassica napus GX-272 and GX29 were selected as the experimentalmaterials.The cotyledons petioles from these four cultivarswere transformed with bar gene from vector of pFGC5941 by agrobacterium-mediated method.According to the number of PPT-resistent plantlets and PCR tests，cotyledon petiole differentiation rate and transformation rate of fourmaterialswere counted respectively.The results showed that cotyledon petiole differentiation rate of Xiangyou 15 and Westarwashigher than that of GX-272 and GX29，while the transformation rate was contrary.In this study，glucosinolate and erucic acid content in rapeseed seed affected on cotyledon petiole differentiation rate and transformation rate was preliminarily confirmed.

Brassica napus L.；Glucosinolate；Erucic acid；Genetic transformation

S565.403.2；Q785

A

1001-5280（2014）03-0242-04 DOI：10.3969／j.issn.1001-5280.2014.03.03

2014 02 10

魏解冰（1988-），男，陕西咸阳人，硕士研究生，Email：baby_usher＠126.com。*通信作者，刘春林，博士，教授，Email：liucl＠hunau.edu.cn。

国家自然科学基金项目（31071455）。