作物遗传育种研究进展Ⅲ.作物基因工程与基因组编辑

（湖南农业大学，长沙410128）

作物遗传育种研究进展Ⅲ.作物基因工程与基因组编辑

刘忠松

（湖南农业大学，长沙410128）

从育种应用角度对利用基因工程和基因组编辑技术拓宽作物遗传变异的意义、特点、原理和基本方法进行了评述，着重介绍了近10年来内源转基因和同源转基因、新靶标基因、多基因工程、叶绿体基因工程和基因组编辑技术的研究新进展，同时比较了它们的优缺点，以期为合理选择利用这些新技术创制新种质提供基础。

作物；遗传育种；基因工程；基因组编辑

遗传变异是育种选择的基础。遗传变异的主要来源一是基因突变，二是基因重组，三是基因转移。传统的基因工程使基因在不同物种间实现转移，是利用基因转移扩大作物遗传变异的重要途径，在作物育种上已经广泛利用，已培育出第一代、第二代转基因作物［1，2］。近年来开发的基因组编辑技术可使作物基因组进行定点改造，通过断裂的双链DNA非同源末端结合或同源重组，导致基因突变、基因重组和基因转移，将在定向改变作物的遗传、拓宽作物遗传变异来源中发挥重要作用。此外，转基因和基因组编辑也是研究基因功能的重要方法。

1 作物基因工程

基因工程是指将不同DNA（或基因）在体外进行酶切和连接，构成重组DNA分子，然后借助生物方法或理化方法将外源基因导入到植物细胞，导入的目的基因整合到植物基因组进行稳定的表达而实现改变植物特定性状的目的。

1.1 内源转基因和同源转基因

由于遗传密码具有通用性，基因可在不同的生物之间进行交流或转译，因而转基因的目的基因可来源于植物、动物和微生物甚或人工合成。第一代转基因作物的目的基因抗除草剂、抗虫基因主要来自于细菌，这引发人们对转基因安全性的担忧。为了解决转基因安全性问题，Rommens［3］和Schouten等［4］提出了intragenesis（内源转基因）和cisgenesis（同源转基因），即利用杂交亲和的植物来源的基因作为转基因的目的基因。在同源转基因中包括启动子、终止子在内的目的基因来自于同种作物或杂交亲和植物，完整转移，不对基因进行改造操作，而在内源转基因中目的基因的各个部分可能来自于同种作物或杂交亲和植物的不同基因，需将不同基因的各功能成分（编码区、启动子、终止子）进行重组（图1）［5］。

图1 同源转基因与内源转基因的比较

1.2 基因工程的新靶标

基因多数编码蛋白质，如编码酶的基因、编码转录因子的基因，但也有不编码蛋白质、而编码RNA的基因，如microRNA基因。第一代甚至第二代转基因主要集中在编码酶的基因，以期改善作物的投入性状（如抗除草剂、抗虫）和产出性状（如富营养化等品质性状）。转录因子可以调控遗传网络中多个基因的表达，利用转录因子基因进行转基因将改变一条路径上全部或多个基因的表达，因此可用于复杂性状（如抗旱性）的改良。但利用转录因子基因进行转基因时，应注意转录因子基因的表达具有时空特征，需要利用组织专一性或诱导性表达启动子［6］。小RNA是指长度短于200个碱基的RNA，包括microRNA、小干扰RNA（siRNA）等，它们通过剪切基因转录本或抑制转录本翻译而使基因沉默，从而调控基因的表达。通过增强或干扰小RNA基因的表达可以改变小RNA基因调控的靶标基因控制的性状的表达（图2）［7～10］。

图2 基于小RNA基因的转基因策略

1.3 多基因基因工程和基因聚合

作物的许多性状都是复杂的遗传调控网络控制的，导致单个基因对性状的改良往往不能凑效，需要同时导入多个有利基因才能达到目的。多基因基因工程有多条途径（图3）［11］。一是基因聚合（图3A），携带不同转基因的植株通过传统育种方法杂交、回交，将转基因聚合到优良品种中，这种转基因聚合方法也叫做育种聚合（breeding stack）。育种聚合花费时间长，能聚合的基因数目有限（4个以内），而且在后代中会发生遗传分离，难以保持。二是重复转化（图3B），转基因植株作为受体材料用另一基因的表达载体再转化。这种途径需要多轮转化，在每次转化时需要用不同的选择标记基因或将标记基因切除，基因分别整合和表达，在后代中分离，需要回交而且难以获得所有转基因的纯合系。三是非连锁基因共转化（图3C），将多个目的基因分别构建载体，然后同时通过农杆菌介导或基因枪方法对受体进行转化，多个基因往往能随机串联整合到受体的同一位点，但对多个基因（3个基因）不适用。四是连锁基因转化（图3D），有时也叫分子聚合（molecular stack），是将多个目的基因转化到同一表达载体，用一个载体进行转化，转基因整合到基因组的一个位点。由于转基因紧密连锁，后代转基因基本不会发生分离。这种途径存在的问题是多个基因（如8～10个基因）在进行克隆、组装时可能需要用不同的启动子［13］，需要有合适的限制酶切位点和载体构建平台［14］。由于合成生物学的兴起，合成DNA或基因方便而高效，这一问题已迎刃而解。另一问题是需要用高容量转化载体如BIBAC、TAC等，即使这样，转化上限也在200 kb以下（一般80～150 kb），而且载体不稳定，容易片段化，位于载体3′端的基因往往表达低。为了克服这一问题，并将更多基因同时进行转化，正在致力于人工染色体或合成染色体研究。人工染色体长达几个Mb，能携带数十甚至数百个基因，且目标基因的导入不会破坏内源基因的表达，因此是多基因转移有希望的载体［15］。

图3 多基因基因工程途径

1.4 叶绿体基因工程

植物细胞除了有细胞核基因组外，细胞质的叶绿体和线粒体也有自己的基因组。尽管线粒体基因工程停滞不前，但叶绿体基因工程已取得突破，近20种双子叶植物都能通过基因枪转化获得质体转基因植株［16］。

与细胞核转基因相比，质体转基因具有4大优势：（1）大多数植物的质体为细胞质遗传，转基因不会通过花粉扩散；（2）一个细胞中有上百个质体，每个质体中有上百个基因组，同质的转基因质体的拷贝数多，导致转基因高水平表达；（3）质体基因不会发生基因沉默，转基因表达稳定；（4）质体基因组为原核基因组，基因以操纵子形式排列，适宜多基因转化。

与核转基因的随机整合不同，叶绿体转基因通过同源重组定点整合到叶绿体基因组（图4B），因此利用叶绿体基因序列作为同源重组序列（图4A）来构建表达框。叶绿体基因组具有原核生物的特点，基因以多顺反子进行表达，且采用基因枪进行叶绿体基因转化，能导入50 kb大小DNA到叶绿体，因此适合多基因的转化（图3E），在光合作用、品质代谢、抗性改良和重组蛋白生产均有重要作用。叶绿体转基因虽然不能通过花粉有性转移，但可以通过无性嫁接实现在细胞间转移［17］，利用嫁接融合体细胞再生将叶绿体转基因转移到其他植物。

叶绿体转基因目前在单子叶植物上尚未取得成功，需要利用绿色叶片进行转化，转化过程繁琐，组织培养必不可少，转基因只在绿色组织高表达，而在非绿色组织是低表达，因此需要研究如何提高非绿色组织叶绿体转基因的表达，利用非绿色组织高表达基因（如accD基因）的启动子和5′端调控元件可能是途径之一。

2 作物基因组编辑

基因工程是将单个或少数几个结构和功能已知的目的基因插入到作物的基因组，而基因组编辑是将DNA双链定点切开，使双链断裂，DNA双链断裂后，能够激活细胞内固有的非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）机制，将断裂的DNA修复，DNA修复过程可导致基因插入、基因点突变、染色体结构变异（图5）［18］。

2.1 基因组编辑的主要特点

基因组编辑是利用蛋白或RNA对基因组的特定序列具有专一识别的特性设计、构建人工内切核酸酶，从而使DNA双链在特定位置断裂，因此这种断裂是位点特异的，可以对基因进行定向突变。

决定基因组编辑的靶标位点短（表1），只要有作物的基因组序列或基因序列，就可以利用计算机进行靶标位点预测，基因组中任意符合条件的位点均可进行编辑，基因组编辑频率高。

基因组编辑既可以通过病毒载体进行瞬时转化，又可以通过农杆菌介导的稳定遗传转化进行。由于基因组编辑是使靶标基因突变，而核酸酶转基因可以通过杂交分离去除，基因组编辑的结果是非转基因植株（图6）［19］。

2.2 基因组编辑技术

从2005年基因组编辑技术出现以来，已开发的基因组编辑技术有锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFN）、类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）和成簇规律间隔短回文重复／Cas9蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR／Cas9）三种技术（图7）［18，20，21］。

ZFN是人工将具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白（zinc finger，ZF）与非特异性核酸内切酶（nuclease）FokⅠ连接合成的酶，其中锌指蛋白负责DNA特异序列的识别，每个锌指蛋白都能够识别一个特定的三联体碱基，在锌指蛋白的指导下FokⅠ二聚体在特定的位置将DNA双链切开。

TALEN是用类转录激活子效应物（TALE）代替了锌指蛋白作为DNA结合域与FokⅠ切割结构连接形成的核酸酶。通过TALE（由33～35个氨基酸的重复序列构成的转录激活子效应因子蛋白）第12位和第13位氨基酸（这两个氨基酸被称为RVDs）识别特异的DNA序列，FokⅠ酶二聚化产生核酸内切酶活性，从而在特定位点将DNA序列精确切开。目前已发现了5种RVDs，分别与特异的碱基对应：组氨酸-天冬氨酸（HD）特异识别碱基C、天冬酰胺-异亮氨酸（NI）识别碱基A、天冬酰胺-天冬酰胺（NN）识别碱基G或A、天冬酰胺-甘氨酸（NG）识别碱基T、天冬酰胺-丝氨酸（NK）可以识别A、T、C、G中的任一种。由于TALEN的RVD对于核苷酸的识别是一一对应的，为识别某一特定氨基酸序列，只需要设计相应TALE单元串联克隆即可，所以TALEN的设计、构建和筛选比ZFN简单得多，具备比ZFN更广阔的应用潜力。

CRISPR／Cas9基因组编辑技术不同于ZFN和TALEN基因组编辑技术，它不是以蛋白质识别DNA序列，而是以一条短的向导RNA识别特异结合的DNA序列，通过CRISPR位点附近的双链DNA核酸内切酶Cas9在向导RNA引导下对靶标位点进行切割。Cas9与FokⅠ酶的功能类似，但是它并不需要形成二聚体就能发挥作用。CRISPR／Cas9基因组编辑技术只需要设计短的向导RNA序列，设计、组装都很方便，因此快速得到了应用，在基因组编辑技术中似有后来居上之势［22，23］。

上述3种基因组编辑技术在原理、修饰效率、构建方法、操作难度以及应用成本等方面具有较大差异（表1）。

表1 基因组编辑技术比较［18，20，21］

2.3 基因组编辑技术改良植物基因组的步骤

（1）分析和确定待改良性状及其目标基因；（2）针对目标基因DNA序列构建1对（或多对）内切核酸酶表达基因盒，并将其装载入合适的植物表达载体；（3）利用农杆菌介导法等遗传转化途径，将工程核酸酶基因表达盒导入目标植物细胞；（4）分化获得转工程核酸酶基因植株；（5）对转基因植株进行剪切位点的DNA序列分析及目标基因的表达分析；（6）对转基因植株进行表型检测，包括目标基因性状和其它主要农艺性状；（7）转基因植株通过自交或与其它材料杂交，筛选剔除转入的外源DNA片段、同时目标基因又得到了修饰的转基因植株；（8）与常规育种技术结合，培育剔除不利性状基因或激活目标基因的植物新品种。在这些环节中，也可以在分化获得转基因植株前，在细胞水平检测不同工程核酸酶的定点剪切效果，并确定是否对工程核酸酶基因表达盒进行优化。

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S330

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2014 04 21

刘忠松（1963-），男，湖南常宁人，博士，教授，从事作物遗传育种研究与教学。