超高效液相色谱串联质谱法测定兽药中3种违禁雌激素

郭捷 花锦 王蓉珍 田海娇

1（山西省分析科学研究院，山西太原030006）

2（山西出入境检验检疫局检验检疫技术中心，山西太原030024）

·食品分析·

超高效液相色谱串联质谱法测定兽药中3种违禁雌激素

郭捷1*花锦2王蓉珍1田海娇1

1（山西省分析科学研究院，山西太原030006）

2（山西出入境检验检疫局检验检疫技术中心，山西太原030024）

建立了饲料级兽药制剂中违禁药物己烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚的超高效液相色谱串联质谱检测方法。用无水乙醇超声提取试样中3种雌激素，以乙腈-水作流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾电离方式（ESI-），通过多反应监测（MRM）定量。该方法灵敏度高，线性关系良好，相关系数达到0.99，回收率在70.9%～98.8%之间，相对标准偏差（RSD）均小于8.3%。本方法快速、简便、精确度高、准确度高，适用于兽药制剂中己烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚违法添加的定性、定量分析。

高效液相色谱-串联质谱；兽药制剂；雌激素；违禁药物

雌激素作为内分泌干扰物之一，有研究表明儿童性早熟、男性前列腺癌、妇女乳腺癌和子宫癌发病率的上升与食品中雌激素的残留有关。我国农业部第193号公告里禁止性激素和具有雌激素样作用的物质在食品动物中的使用。己烯雌酚、双烯雌酚和己烷雌酚为雌激素，很多养殖户对其毒副作用了解不足，常在动物饲养中用作生长素且用药剂量偏高，常造成中毒。因此，为保障食品的安全，内源性和外源性雌激素同时检测就显得尤为重要。

目前兽药制剂中己烯雌酚、双烯雌酚和己烷雌酚的常用检测方法是气相质谱色谱法（GC-MS）、高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）以及荧光光度法（FS）和毛细管电泳法（CAE）等。而对超高效液相色谱-四级杆串联质谱法（UHPLC-MS/MS）的报道甚少，但其具有灵敏度更高、进样更快速、更高效等优势。本文以现有的文献为基础，采用超高效液相色谱-串联质谱法对兽药制剂中3种雌激素添加量进行检测分析，该方法检测灵敏度高、专属性强，对保障兽药安全具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色谱仪，美国Waters公司；TQD串联四极杆质谱仪，美国Waters公司；TALBOYS涡旋混合器；Ultra turrax IKA T18超声波。

乙腈、甲醇，色谱纯，美国Fisher公司；无水乙醇，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；试验用水均为蒸馏水。

己烯雌酚，纯度98.00%；双烯雌酚，纯度100%；己烷雌酚，纯度99.80%，国家生物制品所提供。准确称取的己烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚标准品各10.0 mg，用甲醇分别溶解并准确定容到10 mL，制备成质量浓度为1 000 μg/mL的标准储备液，该溶液可在0℃～4℃冰箱中保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

本试验通过参考文献对多种提取方法进行对比后，采用超声萃取法，简单高效。取1.0 g样品，加入2 mL无水乙醇溶液，后超声10 min，将样液过孔径0.22 μm滤膜至进样瓶，进行LC-MS/MS分析。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：BEHC18柱（50mm×2.1mm，1.8μm）；柱温：35℃；流速：0.3 mL/min；进样量：10 μL；流动相：乙腈和水，梯度洗脱程序见表1。

1.2.3 质谱条件

电离方式：电喷雾电离（ESI-）；扫描方式：负离子扫描；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：380℃；锥孔气流：氮气，流速50 L/h；去溶剂气流：氮气，流速600 L/h；碰撞气：氩气；碰撞气压：3.50×10-4Mpa；毛细管电压：3.5 kV；检测方式：多反应监测（MRM），多反应监测条件见表2。

以现场油井5个月的实际日产油量为依据，对桩59-X30井的生产情况进行历史拟合，通过调节相渗曲线，拟合产油量与实际日产油量。

表1 梯度洗脱程序

表2 离子对、锥孔电压、碰撞能量

2 试验结果

2.1 方法的线性范围

准确移取一定体积的标准储备液，用甲醇稀释成适当质量浓度的标准中间工作液。根据样液中3种雌激素的含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。用甲醇将3种雌激素标准溶液稀释至适当质量浓度（0.00 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.50 mg/L）进行测定，以峰面积（Y轴）对相应的质量浓度（X轴）作图，结果表明己烯雌酚、双烯雌酚和己烷雌酚溶液质量浓度与对应的峰面积呈现良好的线性关系，相关系数均大于0.997 3。以信噪比（S/N）≥10计算，饲料及兽药中己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚的测定低限均为0.2 mg/kg。

2.2 方法的回收率与精密度

按照SN/T 0001标准的规定，禁用物质或未设定容许限的物质，一般选择LOQ、2LOQ、10LOQ作为添加浓度水平进行回收率试验，本方法检测样品中3种雌激素的含量较低，故采用不含以上3种雌激素的的空白样品基质进行3个浓度水平（0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg）的添加回收试验，测得3种物质的回收率范围在70.9%～98.8%之间，RSD范围均在8.3%以下。

表3 LC/MS/MS法检测己烯雌酚、双烯雌酚和己烷雌酚的回收率和精密度

2.3 结果计算

采用外标法定量，按下式计算样品中3种雌激素的含量，计算结果需扣除空白值。

式中：Xi──试样中雌激素含量，mg/kg；

Ci──试液中雌激素质量浓度，μg/L；

V──试样溶液定容体积，mL；

m──试样溶液所代表试样的质量，g；

R──回收率，%。

3 讨论

3.1 流动相的优化

流动相的组成是影响待测物质分离效果和保留时间的重要因素，试验考察了甲醇-水和乙腈-水2种流动相对3种激素的分离效果，结果表明，以甲醇-水作流动相时，3种雌激素分离的峰型不理想，己烯雌酚的峰形出现拖尾；以乙腈-水作流动相效果较好。

3.2 仪器条件的优化

采用自动进样，在负离子模式下进行条件优化；选择己烯雌酚、双烯雌酚和己烷雌酚的最佳分子离子峰及其锥孔电压，然后再对进行一对碎片选择及碰撞能量进行优化；在此优化条件下，3种雌激素的标准溶液色谱图分别见图1，图2，图3。

图1 己烯雌酚（0.1 mg/kg）多反应监测标准色谱图

图2 双烯雌酚（0.1 mg/kg）多反应监测标准色谱图

图3 己烷雌酚（0.1 mg/kg）多反应监测标准色谱图

3.3 不同兽药制剂中3种雌激素非法添加的检测

按照建立的方法对市面上收集的15批兽药制剂喹氟宁、替米考星溶液、氟苯尼考粉、杆痢清、霉毒净、护肝颗粒、蒙脱石粉、蓝天酵素菌、呼支畅、桉薄溶液、硫酸头孢喹肟乳房注入剂（泌乳期）、注射用黄连、防己合剂、盐酸沃尼妙林、盐酸沃尼妙林预混剂10%进行己烯雌酚、双烯雌酚和己烷雌酚非法添加的普查，15份兽药制剂均未检出3种雌激素添加。

4 结论

文中建立了超高效液相色谱串联质谱-电喷雾负离子测定饲料级兽药制剂中非法添加物己烯雌酚、双烯雌酚和己烷雌酚的检测方法，该法快速、简单、有效、回收率高，可很大程度上降低日常检测过程中的检测成本，缩短检测周期，为检测兽药制剂中非法添加己烯雌酚、双烯雌酚和己烷雌酚提供了有效的前处理方法和检测手段。

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Determination of three prohibited estrogens in feed grade veterinary preparations by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

GUO Jie1*HUA Jin2WANG Rong-zhen1TIAN Hai-jiao1

1（Shanxi academy of analytical sciences，Shanxi Taiyuan030006，China）

2（Shanxi entry-exit inspection and quarantine bureau，Shanxi Taiyuan030024，China）

A method of determination of illegal drugs diethylstilbestrol,dienestrol，and hexoestrolin feed grade veterinary preparations by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(UPLC-MS/MS)was developed.Three kinds of estrogens in samples were extracted by ultrasound with ethanol.A gradient system of acetonitrile and water with multi-reaction monitoring（MRM）was employed for quantitative determination.This method has high sensitivity and good linear relationship，the correlation rate was 0.99.The average recoveries ranged from70.9%to98.8% with relative standard deviation less than 8.3%.The determination method was characterized by simplicity,higher sensitivity,and accuracy.It is suitable for qualitative and quantitative analysis of illegal drugs diethylstilbestrol,dienestrol and hexoestrolin feed grade veterinary preparation.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；veterinary preparations；estrogens；illegal drugs

TS202.3

A

1673-6044（2014）04-0048-05

10.3969/j.issn.1673-6044.2014.04.015

*郭捷，女，1963年出生，1985年毕业于山西大学分析化学专业，高级工程师。

2014-12-01