黄药子配伍甘草对大鼠肝脏CYP1A2、CYP2E1蛋白表达影响的实验研究

华碧春，刘娇，黄智锋，史道华，廖华军，林芳

·药理毒理·

黄药子配伍甘草对大鼠肝脏CYP1A2、CYP2E1蛋白表达影响的实验研究

华碧春1，刘娇1，黄智锋1，史道华2，廖华军1，林芳3

目的：研究黄药子和黄药子配伍甘草后对大鼠肝脏组织CYP1A2、CYP2E1蛋白表达的影响。方法：将24只雄性SD大鼠分为3组，分别给药28天，采用HE染色观察肝组织病理损伤，免疫组化法检测大鼠肝脏CYP1A2、CYP2E1蛋白表达的情况。结果：黄药子与甘草配伍能够改善大鼠肝脏组织病变；与对照组比较，黄药子组肝脏CYP1A2、CYP2E1蛋白的阳性表达指数明显升高（P＜0.01）；与黄药子组比较，配伍组肝脏CYP1A2、CYP2E1蛋白的阳性表达指数降低（P＜0.05或P＜0.01）。结论：甘草能对抗黄药子导致的肝损伤，其减毒机理可能与抑制肝脏CYP1A2、CYP2E1蛋白表达有关。

黄药子；配伍；甘草；免疫组化；CYP1A2；CYP2E1

黄药子(Rhizoma Dioscoreae)为薯蓣科薯蓣属植物黄独(Dioscorea bulbifera L.)的块茎[1]。性味苦、辛、凉，有解毒消肿、化痰散结、凉血止血的功效。随着黄药子在临床应用的增加，其临床不良反应主要表现为对肝脏和肾脏的损害[2]。本课题前期实验研究发现，黄药子配伍甘草后可减轻黄药子肝损伤作用[3～5]。另有研究表明：药物性肝损伤的发生与肝组织内CYP450的活性水平有密切关系[6]。故本研究采用免疫组化技术分析黄药子及黄药子配伍甘草对大鼠肝脏CYP1A2、CYP2E1蛋白表达的影响，以期了解甘草与黄药子配伍的减毒机理，为临床安全、合理使用黄药子提供科学依据。

1 材料

1.1 药品及试剂

黄药子（批号120724）、甘草（批号12030506），购于福建回春医药连锁有限公司，经福建中医药大学药学院中药鉴定教研室卢伟教授鉴定为薯蓣科植物黄独Dioscorea bulbifera L.的干燥块茎与豆科植物胀果甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根茎。CYP1A2抗体(货号：ab22717)、CYP2E1抗体(货号：ab19140)购自abcam公司、DAB染色液（链霉菌-生物素法）购自福州迈新生物技术有限公司。

1.2 动物

雄性SD大鼠，体重180～200 g，SPF级，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。许可证号：SCXK（沪）2012-0002，饲养于福建中医药大学实验动物中心。

1.3 仪器

HH-4数显恒温水浴锅、TDL80-2B台式离心机、PYX-DHS-4X50隔水式电热恒温培养箱、ZT-14S（双吊篮）生物组织自动脱水机、YB-6LF生物组织石蜡包埋机、LEICA2235切片机、HFsafe生物安全柜、DM4000B生物显微镜。

2 实验方法

2.1 药液制备

黄药子饮片适量，加入8倍量水浸泡60 min，煎煮，煮沸60 min，药液过滤，药渣再加入5倍量水，煮沸30 min，合并滤液，浓缩至每毫升相当于1 g生药，用时稀释至所需浓度；取黄药子、甘草饮片（1:2），如上法制备，浓缩至每毫升相当于原药材1 g（生药含量以黄药子计），用时稀释至所需浓度。

2.2 动物分组、给药

健康SPF级雄性SD大鼠24只，随机分为3组，黄药子组、黄药子配伍甘草组(后文简称“配伍组”)、对照组，每组8只。黄药子组每日给予黄药子水煎剂9 g．kg-1（相当于常人最大日用量10倍），配伍组给予27 g．kg-1配伍药液，对照组给予同体积蒸馏水，连续给药28天。

2.3 肝组织病理学检测

大鼠禁食12 h，经10%水合氯醛腹腔麻醉，取适量肝脏组织，放入4%多聚甲醛溶液中固定，通过石蜡包埋，制成蜡块。置切片机进行切片，组织切片厚度4 μm，常规脱蜡水化，经苏木精-伊红(HE)染后光镜检查。

2.4 免疫组化法检测肝脏CYP1A2、CYP2E1蛋白表达

采用免疫组化SP法染色，石蜡组织切片经抗原修复，加入相应第一抗体CYP1A2 ( 1:100) 、CYP2E1( 1:200)，加入第二抗体，DAB显色后检测蛋白表达量变化。

结果判断：采用双盲法观察切片，每个标本取5个较好的高倍视野（10×40），按显色范围分为：①+：显色范围占视野＜1/4；②++：显色占视野1/4～2/4；③+++：显色占视野2/4～3/4；④++++：显色占视野＞3/4；显色程度分弱、中、强，用+、++、+++表示(其中+为1、++为2、+++为3、++++为4)。取其均数为每个检测指标的最终显色指数（显色指数=显色程度×显色范围）。

2.5 统计学处理

3 实验结果

3.1 大鼠肝脏组织病理学改变

光镜下观察对照组大鼠肝小叶结构清晰、完整，肝细胞排列规则、整齐，以中央静脉为中心呈放射状，未见坏死、变性。黄药子组肝细胞索排列絮乱，肝细胞若干有明显肿胀，部分细胞质疏松。配伍组肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐，基本接近对照组。见图1。

图1 各组大鼠肝组织病理形态学比较

3.2 对肝脏CYP1A2、CYP2E1蛋白表达的影响

大鼠给予黄药子药液后，CYP1A2、CYP2E1蛋白表达增强，与对照组比较有非常显著差异（P＜0.01）；甘草与黄药子配伍后能够抑制CYP1A2、CYP2E1蛋白表达，与黄药子组比较有非常显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。表明甘草具有一定的减毒作用。见表1、图2。

表1 给药各组对大鼠肝组织CYP1A2、CYP2E1蛋白表达显色指数的比较()

表1 给药各组对大鼠肝组织CYP1A2、CYP2E1蛋白表达显色指数的比较()

注：与对照组比较，*P＜0．05，**P＜0．01；与黄药子组比较，ΔP＜0．05，ΔΔP＜0．01

组别 动物数 CYP1A2 CYP2E1黄药子组 8 5.74±1.55Δ8.03±2.57**配伍组 7 5.74±1.55Δ4.09±1.18ΔΔ对照组 7 1.86±0.34 1.29±0.32

图 2 各组大鼠肝组织CYP1A2、CYP2E1蛋白表达情况

4 讨论

CYP酶分布广泛，但主要存在于肝微粒体，参与各种内源性、外源性化合物在体内的代谢过程[7]。同时在药物的消除过程中起着非常重要的作用，同时也是引起联合用药时药物相互作用产生的主要因素[8]。CYP450家族有多种同工酶，与药物代谢密切相关有CYP1，CYP2，CYP3三个基因家族。在肝脏中，CYP1A2的含量占CYP450蛋白总量的13%，在药物代谢、前致癌物激活的过程中均起着重要的作用，它的活性与许多药物的疗效或毒性以及一些肿瘤的易感性密切相关[9]；CYP2E1占CYP450蛋白总量的7%，该酶仅在肝中表达，可以认为是肝的特异性功能酶，它能够活化前致癌物和毒物，并与肝毒性的发生密切相关[10]。CYP1A2、CYP2E1是CYP450酶系中重要的两个亚型，具有重要药物毒理学意义。

有文献报道：蛋白表达谱变化可能与肝损伤制相关[11]。本实验采用免疫组化技术检测CYP1A2、 CYP2E1蛋白表达情况，探讨黄药子配伍甘草的减毒机制。本实验结果表明：黄药子组CYP1A2、CYP2E1蛋白表达较对照组明显增强，配伍甘草后其表达降低。说明甘草的减毒机制之一可能与其抑制CYP1A2、CYP2E1表达有关。肝损伤的发生与质膜损害、自由基损害、线粒体功能失调、代谢紊乱、细胞内离子浓度改变、细胞因子、一氧化氮、免疫变态反应、细胞调亡等有关[12～13]。甘草配伍黄药子仅通过抑制CYP酶表达减轻毒性作用，还是可能通过更多途径影响黄药子对肝脏的毒性作用尚待进一步探讨，对深入研究甘草配伍黄药子的减毒机制有着重要意义。

[1] 唐迎雪.黄药子古今临床应用研究[J].中国中药杂志,1995, 20(7):435

[2] 林厚文,张罡,赵宏斌,等.黄药子的研究进展[J].中草药,2002, 33(2):175.

[3] 华碧春,胡娟,王瑞国,等.甘草降低黄药子致小鼠肝毒性的实验研究[J].世界中西医结合杂志,2011,6(1):24.

[4] 华碧春,马丽娜.黄药子配伍甘草分煎液与合煎液中黄独乙素含量的比较[C].第五届全国临床中药学学术研讨会论文集,2012:215.

[5] 华碧春,卓实,史道华,等.甘草减轻黄药子肝毒性的研究[J].福建中医药大学学报,2013,23(1):23.

[6] 马小超,屠曾宏.细胞色素P450在药源性肝损伤中的作用[J].世界华人消化杂志,2003,11(3):338.

[7] 温韬,赵金垣.细胞色素氧化酶P450与中毒性肝损伤[J].胃肠病学和肝病学杂志,2007,16(1):82.

[8] 董宇,王阶,杨庆,等.CYP450酶与中药代谢相互作用关系研究概况[J].中国中医药信息杂志,2011,18(1):100.

[9] 李菲,程泽能.与细胞色素P4501A2相关的药物相互作用[J].中国医院用药评价与分析,2002,2(2):114.

[10] 廖乃顺,陈文列.细胞色素氧化酶P450家族在中药毒性研究中的应用进展[J].中国药理学与毒理学杂,2012,26(3):402.

[11] 王坤,金若敏,陈长勋.组学技术应用于药源性肝损伤的研究述评[J].中医学报,2012,27(6):731.

[12] 刘树民.中药药物性肝损伤[M].北京:中国中医药出版社,2007:15.

[13] 刘丹卓,赵新广.肝损伤的现代医学研究进展与展望[J].贵阳中医学院学报,2007,29(3):50.

（责任编辑：陈思敏）

Experimental study on CYP1A2 and CYP2E1 protein expression in liver of rats by combined administration of Huangyaozi and Gancao

HUA Bi-chun1, LIU Jiao1, HUANG Zhi-feng1, SHI Dao-hua2, LIAO Hua-jun1, LIN Fang3//(1.College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuiian 350122, China; 2.Fujian Provincial Maternal and Child Health Hospital, Fuiian 350001,China;3.Longxi Hospital of Traditional Chinese Medicine, Dingxi 748100, Gansu )

Objective:To study the effects of Huangyaozi used alone and combined with Gancao on the protein expression of CYP1A2 and CYP2E1 of the liver in rats.Method:24 SD rats were randomized into 3 groups. After 28 days of administration of drugs respectively, the pathological alterations were observed after HE staining, and the protein expression of CYP1A2 and CYP2E1 of the liver in rats were detected by immunohistochemistry.Result:The compatibility of Huangyaozi and Gancao can amend the liver tissue of rats with lesions. Compared with the control group, the protein expression of CYP1A2 and CYP2E1 of the liver in the Huangyaozi group were signifcantly increased (P＜0.01).Compared with the Huangyaozi Group, the protein expression of CYP1A2 and CYP2E1 of the liver in the combination group were decreased (P＜0.05 or P＜0.01).Conclusion:Gancao can lower the hepatic injury induced by Huangyaozi. The mechanism may be related to the inhibition of CYP1A2 and CYP2E1 protein expression.

Huangyaozi; combination; Gancao; immunohistochemical; CYP1A2; CYP2E1

R 285.5

A

1674-926X(2014)05-010-03

国家自然科学基金课题（81274105）

1.福建中医药大学药学院， 福建 福州，350122；2.福建省妇幼保健院，福建 福州，350001；3.甘肃省陇西县中医院，甘肃 定西，748100

华碧春（1962～），女，教授，硕士生导师，主要从事中药学研究 Email:1625399195@qq.com

2014-02-25