寻常痤疮皮损炎症程度与外周血Th17细胞和IL－17的关系

马新华 邵文俊 金宛宛 高 宇

·论著·

寻常痤疮皮损炎症程度与外周血Th17细胞和IL－17的关系

马新华 邵文俊 金宛宛 高 宇∗

目的: 确定寻常痤疮皮损炎症程度与外周血Th17细胞和IL－17的相关性。方法: 采用流式细胞仪检测外周血Th17细胞水平,酶联吸附试验(ELISA)检测外周血单核细胞IL－17A mRNA的表达,RT－PCR法检测IL－17A mRNA水平。结果: 正常对照组、轻度痤疮组3项指标显著低于中重度痤疮组(P＜0.05),健康对照组和轻度痤疮组之间无显著差别(P＞0.05)。结论: Th17细胞可能和中重度痤疮的发病和炎症性皮损的形成有关,有望通过抑制Th17细胞的作用来治疗中重度痤疮。

痤疮； Th17细胞； 白介素17； IL－17A mRNA

Th17细胞是一类新近发现的CD4＋T细胞,研究发现,Th17细胞在防御细菌感染、介导慢性炎症以及自身免疫病中发挥重要作用。1寻常痤疮表现为面部丘疹、脓疱、囊肿性皮疹,特别是中重度痤疮,临床炎症性皮疹更多,严重程度更重,Th17细胞在中重度痤疮的病理机制中可能有比较重要的意义。通过检测寻常痤疮患者外周血Th17细胞效应因子、数量以及外周血单个核细胞(PBMC)IL－17A mRNA水平,以确定Th17细胞与寻常痤疮发病的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 根据Pillsbury法,2将寻常痤疮患者分为I～IV度,轻度痤疮(即I度)组,中重度痤疮(即II～IV度)组。所有病例为我院门诊患者随机选取32例轻度痤疮患者,35例中重度痤疮患者,30例健康对照组为正常体检者,所入选者2个月内未使用糖皮质激素、免疫抑制剂、抗生素。本研究中临床标本的采集均经温州医学院附属第二医院伦理委员会批准,并同研究对象签署知情同意书。

1.2 主要试剂 本研究所用试剂:培养基RPMI 1640由Hyclone公司提供,灭活胎牛血清由晶美生物公司提供,人IL－17 ELISA试剂盒由美国Rapidbio公司提供,淋巴细胞分离液由上海华精生物公司提供,人Th17 Flow试剂盒为美国eBioscience产品,RNA提取试剂由Invitrogen公司提供,M－Mulv Reverse Transcriptase为Promega公司产品,IL－17A mRNA引物设计、合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.3 实验方法

1.3.1 血清样本以及细胞准备 抽取研究对象的外周血3 mL,室温静置30 min,以1500 r/min离心15 min,取其上清液,于－20℃保存备用,剩余样本加PBS液稀释1倍混匀后加入分离液Ficoll－Hypaque,以1500 r/min离心10 min,用RPMI 1640培养液重悬细胞,调整细胞浓度为2×106/mL,将PBMC接种于24孔培养板置于5%CO2培养箱37℃培养24 h。

1.3.2 IL－17的检测 采用人IL－17 ELISA试剂盒,以及多功能微孔板分析仪,检测各标本IL－17的浓度。

1.3.3 流式细胞术检测Th17细胞 按照人Th17 Flow试剂盒操作说明书,加入渗透洗脱缓冲液重悬细胞,分别加入FICT标记的人CD4抗体和PE标记的人IL－17A抗体,另设同型阴性对照,作流式细胞术分析,用Thl7细胞占外周血CD4＋T细胞的比例来评价Thl7细胞的水平。

1.3.4 检测IL－17A mRNA的表达水平 采用RTPCR法,上游引物5'－GAAGGCAGGAATCACA－3',下游引物:5'－TCCGAAATGAGGCTGTCTT－3'。所设计的上游引物处于IL－17A mRNA的108～123 bp位置,下游引物处IL－17AmRNA的594～612 bp位置,此引物扩增片段长度505 bp。β－actin上游引物:5'－CTTCTACAATGAGCTGCGTGTG－3',下游引物:5'－AGTCATAGTCCGCCTAGAAGCAT－3'。将提取的PBMC,调整浓度为2×106/L,Trizol一步法提取总RNA,用紫外分光光度计测定RNA的A260/A280值以确定RNA的纯度和总量。取各组5μL总RNA,进行逆转录,反应体系为40μL,扩增条件为94℃预变性3 min,94℃30 s,53℃30 s,72℃40 s共28个循环,72℃延伸8min。电泳分析:每个样品取8μL扩增产物, 10 g/L琼脂糖凝胶电泳。应用凝胶成像系统摄取各样品电泳图,并通过成像分析软件Quantity One进行半定量分析。

1.4 统计学方法 所有计量数据均采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析,应用单因素方差分析比较中重度痤疮组、轻度痤疮组和正常对照组各组间的差异。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3组间Th17细胞相关的3项指标比较,见表1。

2.2 Th17细胞占外周血CD4＋细胞比例流式细胞仪检测,见图1,PMBC的IL－17A mRNA表达检测电泳,见图2。

表1 3组外周血IL－17水平、Th17细胞占外周血CD4＋细胞比例以及PBMC中IL－17A mRNA表达水平

图1 流式细胞仪检测不同组别外周血中IL－17细胞所占比例

3 讨论

寻常痤疮皮损是一种原发性炎症反应,细胞因子在痤疮皮损形成中目前研究较多是IL－8,作为趋化因子,在炎性痤疮皮损中表达高于正常皮肤,且与毛囊角化及血管生成成正相关,还与痤疮进展及严重程度有关,阻断IL－8作用可减少由其产生的炎症反应及血管生成,有可能控制轻度痤疮发展为中重度痤疮。3同样,细胞因子IL－1活性的增加也可促进细胞角化,而在痤疮中炎症反应的形成以及毛囊口的角化过程中发挥作用。4在痤疮皮损组织修复过程中过度的免疫反应是造成瘢痕的重要因素,所以早期抗炎治疗将有助于瘢痕倾向患者避免形成瘢痕。5Th17细胞能产生多种细胞因子,其中研究最多的是IL－17,IL－17家族包括6个成员:IL－17A、B、C、D、E和F,通常认为IL－17A与皮肤炎症有关联。有研究者发现,在接种结核分枝杆菌疫苗后,IL－17可促进局部肺组织建立保护性CD4＋T细胞免疫应答。6除了具有促炎症因子的特性,IL－17还可激活中性粒细胞促其迁移募集到炎症部位发挥免疫损伤作用。7IL－17也能够抑制白色念珠菌和曲霉菌感染。8IL－17也能介导炎症,影响感染、肿瘤和免疫的病理过程。9诸多的研究证明,Th17是慢性炎症微环境中重要的效应细胞,在病原体等诱导的慢性炎症过程中发挥重要作用。

寻常痤疮是一种累及毛囊皮脂腺的慢性炎症性疾病,Pillsbury分级法将寻常痤疮进行分级,以表现为黑头粉刺及散在的炎性丘疹分为轻度,轻度痤疮病理表现为毛囊漏斗内的角化细胞潴留及毛囊漏斗部囊状扩张,炎性细胞浸润较少。而中重度痤疮表现为炎性的丘疹、脓疱,以及结节和囊肿,其病理表现为毛囊漏斗上皮的破裂,中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、异物巨细胞聚集,明显的炎症临床及病理表现。

图2 RT－PCR检测各组外周血单个核细胞IL－17A mRNA表达

我们发现中重度痤疮患者Th17细胞及其效应因子、IL－17A mRNA表达水平明显高于正常对照组以及轻度痤疮患者,差异具有统计学意义,而轻度痤疮患者与正常对照组之间无显著差异。这些结果提示:有可能Th17细胞在形成中重度痤疮炎症性的皮疹中发挥重要作用,特别是对于炎症强烈的脓肿、囊肿的形成可能有重要的意义,这也进一步证实了Th17细胞促进炎性反应、募集中性粒细胞的作用。而中重度痤疮患者外周血中Th17细胞活性增强的机制,目前未明,有待进一步研究。

Th17细胞有可能成为治疗中重度痤疮新的靶点,即通过阻断Th17细胞的作用,来阻断寻常痤疮的炎症加重,促进炎症的恢复。

1 Bettelli E,Korn T,Kuchroo VK.Th17:the third member of the effector T cell trilogy.Curr Opin Immunol,2007,19:652－657.

2张学军.皮肤性病学.8版.北京:人民卫生出版社,2013.175－177.

3Abd EAHS,Shoukry NS,El MRA,et al.Immunohistochemical expression of interleukin 8 in skin biopsies from patientswith inflammatory acne vulgaris.Diagn Pathol,2007,2:4.

4 Jeremy AH,Holland DB,Roberts SG,et al.Inflammatory events are involved in acne lesion initiation.J Invest Dermatol, 2003,121:20－27.

5 Holland DB,Jeremy AH,Roberts SG,et al.Inflammation in acne scarring:a comparison of the responses in lesions from patients prone and notprone to scar.Br JDermatol,2004,150:72－81.

6Khader SA,Cooper AM.IL－23 and IL－17 in tuberculosis.Cytokine,2008,41:79－83.

7 Caruso R,Pallone F,Monteleone G.Emerging role of IL－23/IL－17 axis in H pylori－associated pathology.World J Gastroenterol,2007,13:5547－5551.

8 Zelante T,De Luca A,Bonifazi P,et al.IL－23 and the Th17 pathway promote inflammation and impair antifungal immune resistance.Eur J Immunol,2007,37:2695－2706.

9 Park H,LiZ,Yang XO,etal.A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17.Nat Immunol,2005,6:1133－1141.

(收稿:2013－08－22 修回:2013－11－03)

The relationship between the severity of the lesion and Th17 cells and IL－17 level in the peripheral blood of patientswith acne vulgaris

MAXin-hua,SHAOWen-jun,JINWan-wan,et al.Department of Dermatology,Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027

Objective:To correlate the severity of the lesion and the level of Th17 cells,and the expression of IL－17 among the patientswith acne vulgaris.Methods:The Th17 cells in the peripheral blood were evaluated by flow cytometry.The IL－17 level in the peripheral blood wasmeasured by enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA).The level of IL－17A mRNA was detected by RT－PCR.Results:The level of the three parametersmentioned above was lower in healthy controls and the patientswithmild degree of acne vulgaris than in the patientswithmid－and severe acne vulgaris(P＜0.05).Therewas no significant difference in the three parameters between the healthy controls and the patients with mild acne vulgaris(P＞0.05).Conclusion:Th17 cellsmay be involved in the developmentofmid－and severe acne vulgaris and the formation of inflammatory lesions.

acne；Thl7 cells；IL－17；IL－17A mRNA

浙江省温州市科技局课题(编号:Y20120173)

温州医科大学附属第二医院皮肤科,温州,325027

∗通信作者