Livin和Smac在鲍恩病及皮肤鳞状细胞癌中的表达

李春霞 魏红军 郜玉玲 史同新 李 民 曲才杰

Livin和Smac在鲍恩病及皮肤鳞状细胞癌中的表达

李春霞 魏红军 郜玉玲 史同新 李 民 曲才杰∗

目的: 确定Livin和Smac在鲍恩病(BD)及皮肤鳞状细胞癌(SCC)中的表达和意义。方法:应用免疫组化SP法检测35例BD和32例SCC中Livin和Smac的表达,分析二者表达的相关性。结果: Livin表达:BD组高于BD癌旁组织(P＜0.001)；BD癌旁组织高于正常对照组(P＜0.05)。SCC组高于SCC癌旁组织(P＜0.001)；SCC癌旁组织高于正常对照组(P＜0.05)。SCC组高于BD组(P＜0.05)。Smac表达:BD组低于BD癌旁组织(P＜0.01)；BD癌旁组织低于正常对照组(P＜0.05)；SCC组低于SCC癌旁组织(P＜0.001)；SCC癌旁组织低于正常对照组(P＜0.05)；SCC组低于BD组(P＜0.05)。Livin和Smac在BD中表达无相关性(P＞0.05),在SCC中表达呈负相关(P＜0.05)。结论: Livin的过表达和Smac的低表达可能在BD和SCC的发生、发展中起一定作用。

鲍恩病； 癌； 鳞状细胞； Livin； Smac

鲍恩病(Bowen's disease,BD)和皮肤鳞状细胞癌(Squamous cell carcinoma,SCC)是常见的皮肤恶性肿瘤,其中BD属于原位鳞状细胞癌,少数可发展为侵袭性鳞状细胞癌。细胞凋亡调控异常在肿瘤形成过程中起十分重要的作用。Livin是凋亡抑制蛋白家族(IAPs)新成员,在大多数恶性肿瘤细胞中高表达,抑制细胞的凋亡。Smac为第二个线粒体衍生的半胱氨酸蛋白酶激活剂,通过去除IAPs对半胱氨酸蛋白酶的抑制作用,促进细胞的凋亡。本研究利用免疫组织化学技术分析Livin和Smac在BD、皮肤SCC以及癌旁组织中的表达,以探讨Livin和Smac在BD和皮肤SCC的发生、发展中所起的作用。

1 对象与方法

1.1 对象和试剂 32例SCC和35例BD标本均来自青岛市市立医院皮肤科2007年1月至2012年6月资料保存完整的病例。其中男37例,女30例,男:女为1.23∶1,年龄41～90岁,平均72.4±13.0岁,病程1个月～10年,平均1.7±1.2年。所有病例均无淋巴结转移。35例BD中皮损单发33例,其中发生于头面部6例,躯干12例,四肢13例,手背1例,甲床1例。多发2例,其中1例累及躯干和四肢,1例累及头皮、躯干和四肢。32例SCC均为单发,其中发生于头面部8例,躯干8例,四肢7例,口唇3例,女阴3例,阴茎2例,肛周1例。32例SCC按Broder分级标准1均为I级。对照组30例为皮肤外科美容手术中修剪遗弃的正常皮肤。

兔抗人Livin多克隆抗体,工作浓度1∶200,兔抗人Smac多克隆抗体,工作浓度1∶100,均购自北京博奥森生物技术有限公司。通用型免疫组化试剂盒和DAB显色剂购于福建迈新生物技术公司。

1.2 方法 Livin和Smac的检测均采用免疫组化SP法,实验步骤严格按照试剂盒说明书进行,用已知染色阳性的组织切片为阳性对照,用PBS代替一抗为阴性对照。

结果判定标准:Livin阳性表达为细胞质和(或)细胞核内出现棕黄色颗粒,Smac阳性表达为细胞质内出现棕黄色颗粒。参考文献2的半定量计数方法,根据肿瘤细胞的染色率和染色强度进行判定。在400倍镜下随机选取10个视野,每个视野计数100个肿瘤细胞,观察细胞的染色强度,计算阳性细胞百分率。肿瘤细胞阳性率＜5%为0分,5%～25%为1分,26%～50%为2分,51%～75%为3分,＞75%为4分；根据染色强度分为4级,无着色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。每个视野阳性细胞百分率与染色强度得分相乘为该视野得分,最终得分为5个视野得分的平均值。0～4分为阴性,5～8分为阳性,9～12分为强阳性。以阳性例数和强阳性例数合并计算阳性率。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行χ2检验及Spearman相关分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Livin和Smac的表达 Livin在BD和SCC的表达见表1。Livin在BD中表达强阳性14例(图1),阳性12例(图2),阳性率为74.29%；在BD癌旁组织和正常对照组阳性率分别为22.88%和3.33%。Livin在BD中表达率高于BD癌旁组织(χ2＝18.529,P＜0.001)和正常对照组(χ2＝33.488,P＜0.001)；在BD癌旁组织表达率高于正常对照组(χ2＝5.162,P＜0.05)。Livin在SCC中表达强阳性21例(图3),阳性9例(图4),阳性率为93.75%；在SCC癌旁组织阳性率为25.00%。Livin在SCC中表达率高于癌旁组织(χ2＝31.352,P＜0.001)和正常对照组(χ2＝50.633,P＜0.001)；在SCC癌旁组织表达率高于正常对照组(χ2＝5.858,P＜0.05)。Livin在SCC中的表达率高于BD (χ2＝4.615,P＜0.05)。

Smac在SCC和BD的表达情况见表1。Smac在BD中表达强阳性8例,阳性10例,阴性17例(图5),阳性率为51.43%；在BD癌旁组织和正常对照组阳性率分别为82.86%和100.00%。Smac在BD中表达率低于癌旁组织(χ2＝7.835,P＜0.01)和正常对照组(χ2＝19.732,P＜0.001)；在BD癌旁组织表达率低于正常对照组(χ2＝5.666,P＜0.05)。Smac在SCC中表达强阳性1例,阳性7例,阴性24例(图6),阳性率为25%；在SCC癌旁组织阳性率为84.38%。Smac在SCC中表达率低于癌旁组织(χ2＝22.763,P＜0.001)和正常对照组(χ2＝36.711,P＜0.001)；在SCC癌旁组织表达率低于正常对照组(χ2＝5.099,P＜0.05)。Smac在SCC中的表达率低于BD(χ2＝4.917,P＜0.05)。

2.2 Livin和Smac在BD和SCC中表达的相关性见表2、3。经Spearman相关性分析。Livin和Smac在BD中表达无相关性(r＝－0.210,P＞0.05)；Livin和Smac在SCC中的表达呈负相关(r＝－0.415,P＜0.05)。

表1 Livin和Smac在BD和SCC中的表达

图1 Livin在BD中强阳性表达(箭头),细胞质及细胞核呈棕褐色(SP法,×100)图2 Livin在BD中阳性表达(箭头),细胞质及细胞核呈淡褐色(SP法,×100)图3 Livin在SCC中强阳性表达(箭头),细胞质及细胞核呈棕褐色(SP法,×100)图4 Livin在SCC中阳性表达(箭头),细胞质及细胞核呈淡褐色(SP法,×100)图5 Smac在BD中阴性表达(箭头),细胞质无着色(SP法,×100)图6 Smac在SCC中阴性表达(箭头),细胞质无着色(SP法,×100)

表2 Livin和Smac在BD中表达的相关性

表3 Livin和Smac在SCC中表达的相关性

3 讨论

Livin是凋亡抑制蛋白家族的新成员,其N端含有一个高度保守的长约70个氨基酸的杆状病毒IAPs重复序列(baculovirus IAP repeats,BIR),Livin通过其BIR区与Caspase结合,抑制Caspase的活性,从而抑制细胞的凋亡。Livin在正常人的大多数终末组织中(胎盘除外)低表达或不表达,在大多数恶性肿瘤中高表达。3－5少数研究发现Livin在皮肤SCC中的表达高于正常表皮,认为Livin蛋白的异常表达可能与SCC的发生、发展有关。12,13我们的研究显示Livin在 SCC中的表达高于正常表皮,文献报道相似。关于Livin在BD中的表达尚未见报道,本研究显示Livin在BD中的表达高于正常表皮,但低于SCC,提示Livin蛋白的异常表达可能与BD的发生有关,也可能在BD发展为侵袭性SCC过程中起一定作用。

Smac为第二个线粒体衍生的半胱氨酸蛋白酶激活剂(second mitochondria－derived activator of caspase),Smac在正常成人的睾丸表达水平最高,在心脏、肝脏、肾脏等也有较高表达,在脑、肺、胸腺及外周血中为低表达。Smac在正常细胞中不诱发凋亡,在受损细胞中,Smac通过与IAPs的BIR结构域结合,解除IAPs对Caspase的抑制,诱导细胞凋亡。Yoo等6研究了Smac在不同肿瘤中的表达情况,结果显示:Smac在癌症中的表达率为62%,其中胃癌42/60,结肠癌7/10,肺癌4/10,卵巢癌7/10,前列腺癌2/10；在肉瘤中表达率为22%,其中恶性神经鞘病2/8,横纹肌肉瘤5/11,皮肤纤维肉瘤2/7,平滑肌肉瘤1/6,尤文肉瘤1/2,8例血管肉瘤和8例脂肪肉瘤中均无表达。表明Smac在不同肿瘤中的表达不同。一些研究发现Smac在肝癌、胰腺癌、胃癌、口腔鳞癌、皮肤鳞癌组织中的表达低于正常,7－9,11,12在非小细胞肺癌、骨肉瘤组织中的表达高于正常。5,10我们的研究显示Smac在皮肤SCC中的表达低于正常表皮,提示Smac低表达可能在皮肤SCC的发病中起一定作用。Smac在BD中表达情况目前尚无报道,本研究显示Smac在BD中的表达低于正常表皮,但高于皮肤SCC,提示Smac蛋白的异常表达可能与BD的发生有关,也可能在BD发展为侵袭性SCC过程中起一定作用。

癌旁组织是指邻近肿瘤病灶,组织学无恶变特征的组织。本研究显示Livin在BD和SCC的癌旁组织中的表达低于BD和SCC,但均高于正常对照组,而Smac在BD和SCC的癌旁组织中的表达高于BD和SCC,但均低于正常对照组,提示癌旁组织虽然组织学表现正常,但其凋亡调控已经出现异常,具有恶变倾向。

Livin和Smac在不同肿瘤中表达的相关性报道不一,一些研究显示Livin和Smac在非小细胞肺癌和骨肉瘤中均为高表达,二者表达呈正相关。5,10另外一些研究显示Livin蛋白在肝癌、胰腺癌和胃癌组织中表达高于正常,而Smac蛋白在肝癌、胰腺癌和胃癌组织中表达低于正常,二者表达呈负相关,从而认为Livin可能在某些肿瘤的发生、发展中起重要促进作用,而Smac在预防某些肿瘤的的发生、发展中起一定的作用。7－9

本研究显示Livin在BD和SCC中高表达,Smac在BD和SCC中低表达,二者在BD中表达的相关性无统计学意义,在皮肤SCC中的表达呈负相关,Livin高表达和Smac低表达可能共同参与了BD和皮肤SCC的发生、发展。Livin通过与Caspase结合发挥其抗凋亡作用,Smac通过与Livin结合抑制Livin的抗凋亡作用,发挥其促凋亡作用。Livin的RNG结构具有E3(泛素连接酶)活性,Smac与Livin结合后,Livin通过泛素－蛋白酶体途径促进Smac降解。总之,抗凋亡蛋白Livin和促凋亡蛋白Smac之间存在着相互拮抗,相互调节的关系。二者表达失调可能共同参与了BD和皮肤SCC的发生、发展。

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13陶菲克,涂亚庭.Livin和Caspase－3在皮肤基底细胞癌和皮肤鳞状细胞癌中的表达及相关性分析.中国皮肤性病学杂志,2009,23(2):88－94.

(收稿:2013－09－08 修回:2013－10－15)

The expression and significance of Livin and Smac protein in Bowen's disease and skin squamous cell carcinoma

LIChun-xia,WEIHong-jun,GAO Yu-ling,et al.Department of Dermatology,Qingdao Municipal Hospital, Qingdao,266011

Objective:To investigate the expression and significance of Livin and Smac protein in Bowen's disease(BD)and skin squamous cell carcinoma(SCC).Methods:Immmunohistochemical SP method was used to detect the expression of Livin and Smac in 35 cases of BD and 32 cases of SCC.The relationship between the expressions of BD and Smac was analyzed.Results:The expression of Livin was higher in BD group than in adjacent tissue of BD(P＜0.001)and higher in adjacent tissue of BD than in control group(P＜0.05). The expression of Livin was higher in SCC group than in adjacent tissue of SCC(P＜0.001)and was higher in adjacent tissue of SCC than in control group(P＜0.05).The expression of Livin was higher in SCC group than in BD group(P＜0.05).The expression of Smac was lower in BD group than in adjacent tissue of BD(P＜0.001)and lower in adjacent tissue of BD than in control group(P＜0.05).The expression of Smac was lower in SCC group than in adjacent tissue of SCC(P＜0.001)and was lower in adjacent tissue of SCC than in control group(P＜0.05).The expression of Smac was lower in SCC group than in BD group(P＜0.05).There was no relationship between the expression of Livin and Smac in BD(P＞0.05).There was a negative relationship between the expression of Livin and Smac in SCC(P＜0.05).Conclusion:The over－expression of Livin and low expression of Smacmay be involved in the occurrence and development of BD and SCC.

Bowen's disease；carcinoma；squamous cell；Livin；Smac

青岛市市立医院,山东青岛,266011

∗通信作者