厚朴汁炙远志炮制品对胃间质细胞活力影响的探讨

唐丹霞，王建，郑新光，黄大智

·药理毒理·

厚朴汁炙远志炮制品对胃间质细胞活力影响的探讨

唐丹霞，王建，郑新光，黄大智

目的：探索研究不同剂量厚朴汁炙远志炮制品对胃间质细胞活力的影响。方法：将实验分成空白组、远志组、厚朴组、厚朴汁炙远志高、中、低剂量组、远志配厚朴1:2组七个不同剂量组对培养的胃间质细胞进行干预，24 h后采用四唑盐比色实验（MTT法），考察厚朴炮制远志的水煎液及其含药血清对胃间质细胞活力的影响。结果：厚朴汁炙远志炮制品水煎液对胃间质细胞活力的影响结果显示，与单味生远志20 g．kg-1组比较，空白组、单味厚朴10 g．kg-1组、炮制高剂量30 g．kg-1组、远志配厚朴1:2（30 g．kg-1）组的胃间质细胞OD值均显著增高（F=2.750，P=0.024）；厚朴汁炙远志炮制品含药血清对胃间质细胞活力的影响结果显示，炮制高剂量30 g．kg-1组、远志配厚朴1:2（30 g．kg-1）组的含药血清的胃间质细胞OD值均显著高于空白组（F=10.22，P=0.000）；且单味厚朴10 g．kg-1组、炮制高剂量30 g．kg-1组、远志配厚朴1:2组（30 g．kg-1）的OD值均显著高于单味远志组（F=10.22，P＜0.05）。结论：远志有抑制胃动力起搏细胞活性趋势，单味厚朴组、厚朴汁炙远志炮制品组、远志配厚朴1:2组均能极显著促进胃间质细胞活力，从而促进胃动力，故推测厚朴能通过促进胃间质细胞的活力，在配伍和炮制过程中降低远志对胃间质细胞造成的伤害，而达到缓解胃肠动力障碍的目的。

]远志；厚朴；炮制品；胃间质细胞；MTT

炮制是中药应用中不可缺少的一门技术，其主要目的是减毒、增效、矫味、纠性、保质量、纯净药材、易于贮存。通过药汁制备药物是以中医药基本理论为原则，治法为依据，针对病情需要，结合药物特性进行组合炮制。研究发现，远志为临床常用药，具有安神益智、祛痰止咳、消肿止痛[1]的功效，长期应用能显著抑制胃肠动力[2]，厚朴汁炮制远志是较为罕有的炮制方式[3]。其理论基础是厚朴与远志配伍能有效降低远志的胃肠毒副作用，同时也保留了远志的功效。由配伍的基础研究，延生到炮制的应用研究，既可以增加炙远志的应用范围，亦能突出远志的临床应用，便于广大的医疗工作者和患者接受。

鉴于此，本次实验以胃Cajal间质细胞（ICC）为切入点，研究厚朴汁炙远志对ICC细胞活力的影响，为从细胞水平阐释厚朴汁炙远志缓解胃肠动力障碍的科学内涵，也为临床合理用药提供参考。

1 实验与方法

1.1 试验药物

远志、厚朴均购于西南药都中药材市场，经成都中医药大学卢先明教授鉴定为远志Polygala tenuifolia Willd.的干燥根，厚朴Magnolia officinalis Rehd.et Wils.的树皮、干皮，均属《中华人民共和国药典》收载品种。

1.2 实验动物

昆明种小鼠，出生后9～14天，SD 种大鼠，180～220 g，雌雄不拘，由成都中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(川)2004-11。

1.3 试剂

类标准胎牛血清（兰州民海公司，批号：20120905）；完全DMEM培养基（Gibco产品，批号：904862）；二型胶原酶（Biosharp公司，批号：0458）；DMSO（Sigma公司，批号：0231）；MTT（Sigma公司，批号：0793）；SCF(PEPROTECH 公司，批号110978H1014)；羊抗兔FITC 标记荧光抗体( Vector，批号：91387) ；封闭用羊血清( 北京中杉金桥，批号L2104)；c-kit 抗体( 武汉博士德) 。

1.4 实验器材

酶标定量测定仪（Thermo Multiskan AsCant公司）；二氧化碳细胞培养箱（日本SANYO公司）；超净工作台（苏州安泰公司）；倒置显微镜（日本OLYMPUS）；微量移液器(芬兰)；MILL-Q纯水仪(美国Millipore公司) 。

1.5 含药血清的制备

取健康SD大鼠35只，体重180～ 220 g，雌雄兼用，按性别体重随机将大鼠分为空白组，厚朴10 g．kg-1组，远志20 g．kg-1组，厚朴汁炙远志炮制品含药血清高剂量30 g．kg-1（1：2）组，炮制品中剂量15 g．kg-1（1：2）组，炮制品低剂量7.5 g．kg-1（1：2）组，远志配厚朴1:2组30 g．kg-1。每组5只，每只小鼠按10 mL．kg-1灌胃给予相应药液，空白组给予同体积生理盐水,连续给药3 d，分2次给药（早、晚）。最后1 d一次性给药60 min后，股总动脉取血。静置4℃冰箱，60 min后离心3000 r/min×10 min，收集各组的上清血清， 经0.45 μm 的滤器过滤除菌，灭活56℃ 30 min。将含药血清用培养基稀释成15%体积，置- 20℃冰箱备用。

1.6 方法

1.6.1 胃间质细胞培养 取出生12 d的健康昆明种小鼠，禁食18 h，颈部脱臼致死，固定鼠的头及四肢，碘伏、酒精消毒，立即剖开腹腔，自贲门和幽门处分离组织，取出胃( 包括胃底、胃体和幽门)置于4 ℃PBS液( 200 U．mL-1抗菌素) 小心去除系膜，沿小弯缘剪开胃， 洗净内容物， 锐性去除黏膜和黏膜下层。将分离出的肌肉组织置于含1 mL二型胶原酶的小烧瓶中剪碎至约1～2 mm3小块，转移至含9 mL二型胶原酶( 1.3 mg．mL-1) 培养皿中37℃消化25～30 min。于消化结束后的组织液中加入等体积PBS液，离心1500 r /min×3 min。弃去上清，DMEM重悬细胞与等体积小鼠淋巴分离液上离心2000 r/min×6 min，取液面交界细胞层，加入含5 ng．mL-1的15%胎牛血清的培养基，吹打，混匀，再接种到96孔板中。37 ℃、5% CO2培养箱中孵育，24 h后换液弃去未贴壁细胞，继续培养，以后每2～3 d换液一次。

1.6.2 MTT法 将接种了GICC 的96孔板培养至8d (对数生长期) ，依据空白组、远志组、厚朴组、厚朴汁炙远志高、中、低剂量组、远志配厚朴1:2组分组，分别滴加原生药液。24 h后， 每孔加入MTT 溶液( 5 mg．mL-1) 20 μL，37℃继续孵育4 h，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min，使充分溶解。选择490 nm波长，用酶联免疫检测仪测定各孔光吸收( OD) 值，记录结果。

2 结果

2.1 c-kit免疫荧光鉴定、正常细胞倒置显微镜下形态如下图1、2。

图2 倒置显微镜各型ICC（×100）

Cajal形成3～5个细胞厚的薄细胞层，其细胞突起以缝隙连接互相联系成ICC网络并与平滑肌细胞联系。培养3 d后，可分辨出胃间质细胞形态，胞体是三角形，可见大的细胞核，核周胞质少，突起伸展。培养5 d后，胃间质细胞形态更加清晰，自胞体发出的突起向周围伸长（图1）。培养7 d后，相邻胃间质细胞突起间有连接形成，部分胃间质细胞的细胞突起与邻近平滑肌细胞也形成连接（图2）。培养9 d后，胃间质细胞突起向各方向伸出，在初级分支上还可见二级分支，与相邻胃间质细胞和平滑肌细胞形成连接，胃间质细胞突起交织，形成小的、较为分散的网络。

2.2 厚朴汁炙远志炮制品水煎液对胃间质细胞活力的影响

结果显示，与空白组比较，单味厚朴组、炮制高剂量组的OD值均显著增加（P＜0.05，P＜0.01）；与单味远志组比较，单味厚朴组、炮制高剂量组、远志配厚朴1:2组的OD值也显著增加（P＜0.05）。与空白组比较，单味远志组的OD值略有下降趋势，但无显著性差异（P＞0.05），实验结果见表1。

表1 厚朴汁炙远志炮制品水煎液对胃间质细胞活力的影响(±s，n=7)

表1 厚朴汁炙远志炮制品水煎液对胃间质细胞活力的影响(±s，n=7)

注：与空白组比较： * P＜0.05；与远志组比较：△P＜0.05

组别 剂 量（µg．µL-1） OD（OD490）空白组 同体积DMEM液 0.675±0.055远志组 5 0.670±0.130厚朴组 10 0.716±0.176*△厚朴汁炙远志药液高剂量组 15 0.842±0.159*△厚朴汁炙远志药液中剂量组 7.5 0.778±0.104厚朴汁炙远志药液低剂量组 3.75 0.626±0.060远志配厚朴1:2组 15 0.814±0.129△

2.3 厚朴汁炙远志炮制品含药血清对胃间质细胞活力的影响

结果显示，与空白组比较，单味远志含药血清能显著降低OD值（P＜0.05 )；但单味厚朴组、炮制高剂量组、配伍1∶2含药血清组的OD值均显著高于空白组（P＜0.05）；与单味远志含药血清比较，单味厚朴组、炮制高剂量组、远志配厚朴1:2组的OD值极显著升高（P＜0.01），实验结果见表2。

表2 厚朴汁炙远志炮制品含药血清对胃间质细胞活力的影响(±s，n=7 )

表2 厚朴汁炙远志炮制品含药血清对胃间质细胞活力的影响(±s，n=7 )

注：与空白组比较： * P＜0.05，**P＜0.01；与远志组比较：△P＜0.05,△△P＜0.01

组别 给药剂量（g．kg-1） OD（OD490）空白组 生理盐水 0.546±0.066△远志组 10 0.459±0.037*厚朴组 20 0.553±0.075*△△厚朴汁炙远志含药血清高剂量组 30 0.729±0.054**△△厚朴汁炙远志含药血清中剂量组 15 0.510±0.042厚朴汁炙远志含药血清低剂量组 7.5 0.518±0.071远志配厚朴1:2含药血清组 30（1 2） 0.624±0.070*△△

3 讨论

研究发现单味远志具有抑制胃肠动力和粘膜损伤的副作用，为了降低远志的不良反应，课题组前期从炮制角度展开了较系统研究，结果表明远志的毒性成分即皂苷类部位能在体内造成的胃肠动力障碍，这种作用可以得到厚朴中的主要成分（如：厚朴酚、和厚朴酚等）的有效缓解[1]，即厚朴汁炙远志炮制品具有减毒增效的作用。Cajal间质细胞分布于整个胃肠道[4]，是胃肠道的起搏细胞，并在神经信号传递中起着重要作用[5～6]，与某些胃动力疾病的发病有关。课题组前期研究发现，远志能显著，抑制ICC活力，厚朴配远志1∶2能显著增强ICC活力[7]。基于以上基础，本次实验以厚朴汁炙远志炮制品为研究重点，建立成熟的体外模型，再次开展关于炮制品“减副存效”的研究。其结果显示，水煎液中远志有抑制胃动力起搏细胞活性的趋势，而含药血清中，远志组能显著抑制ICC活性（* P＜0.05）；炮制品高剂量组、配伍组不管是水煎液还是含药血清均能显著增强GICC活性。说明此炮制方法对于体外实验可取。而含药血清实验结果更显著提示采用含药血清的方，法观测对生长状况良好的ICC影响，既可避免对细胞的刺激性又能反映药物吸收后的作用原理。原生药液的pH值、渗透压等会对细胞生长带来不利影响，导致细胞损伤，影响实验结果的准确性，而含药血清则可排除此种影响，这可能与药物在体内代谢之后成分有所变化有关，具体物质代谢基础及生物学机制，还有待今后深入研究。

关于GICC的体外培养方法报道较多，但实验过程中影响因素较多，培养过程艰难，故对培养小鼠GICC作出以下经验总结：①消化过程中，时间不易掌握，实验开始前，将消化液置于37℃孵箱中预热，使酶的活性达到最佳。将组织洗净后应置于1 mL消化液中剪碎，使其表面能与酶充分接触，剪碎之后再将组织转移至含有9 mL消化液的玻璃培养瓶中，夏季消化30 min，冬季可延长消化至35 min，15 min吹打一次，这是本次实验过程中的创新点。②由于胃体平滑肌发达，故杂细胞较多，离心过滤之后DMEM重悬细胞与等体积小鼠淋巴分离液再次离心2000 r/min×6 min，取液面交界细胞层，加入含5 ng．mL-1的15%胎牛血清的培养基，吹打，混匀，再接种到96孔板中。

[1] 乔建彬.远志的三大药用功效[J].家庭中医药,2006,1(12):66.

[2] 马骁,王建,黄聪,等.厚朴炙远志炮制品的安神和祛痰作用研究[J].中药药理与临床,2013,29(1):90.

[3] 王建,郭娟,刘贤武,等.生远志及与甘草不同配伍比例对小鼠胃肠运动的影响[J].中药药理与临床,2002,18(5):27.

[4] Jain D,Moussa K,Tandon M,et al. Role of interstitial cells of Cajal in the motility disorders of bowel[J].Am J Gastroenterol,2003, 98(3) :18.

[5] Kito Y,Suzuki H. Properties of pacemaker potentials recorded from myenteric interstitial cells of Cajal distributed in the mouse small intestine[J]．J Physiol,2003,553:803.

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[7] 刘丽娜,王建,肖武,等.远志与厚朴配伍对小鼠胃间质细胞活性的影响[J].中药药理与临床,2011,27(1):66.

（责任编辑：陈思敏）

The effect of Yuanzhi decoction processed with Houpo juice on the mice interstitial cells of Cajal/

TANG Dan-xia, WANGJian, ZHENG Xin-guang, HUANG Da-zhi//(Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China )

Objective: To explore the effect of Yuanzhi decoction processed with Houpo juice on the miceinterstitial cells of Cajal. Method: The research objectives was divided into seven different groups that named blank group, Yuanzhi group, Houpo group, Yuanzhi decoction processed with Houpo juice high, middle, low groups, Yuanzhi with Houpo 1:2 group. And then the MTT method was used to investigate the effect of Yuanzhi decoction processed with Houpo juice and its drug-containing serum on the mice Interstitial cells of Cajal after 24 hours. Result: The result of Yuanzhi decoction processed with Houpo juice showed that compared with the Yuanzhi 10 g．kg-1group, GICC OD values of the blank group, Houpo juice 30 g．kg-1, high processing 30 g/kg dose group, Yuanzhi with Houpo juice 1:2 (30 g．kg-1) were signifcantly increased （F=2.750，P=0.024）. The infuence of containing medicine serum of Yuanzhi decoction processed with Houpo on GICC showed that OD values of GICC of processing high 30 g．kg-1dose group, Yuanzhi with Houpo juice 1:2 (30 g．kg-1) of drug-containing serum of were signifcantly higher than the blank group (F=10.22，P=0.000). And OD values of Houpo juice 10 g．kg-1, high processing 30 g．kg-1dose group, Yuanzhi with Houpo 1:2 (30 g．kg-1) were signifcantly higher than in Yuanzhi group (F=10.22，P＜0.05). Conclusion: Yuanzhi can restrain the activity of GICC pacemaker cytoactive. Houpo group, Yuanzhi decoction processed with Houpo juice products, Yuanzhi with Houpo 1:2 groups can signifcantly promote the GICC vitality to promote gastric dynamics. So it can be speculated that Houpo reduce the harm from Yuanzhi during the process of compatibility and processing, and achieve the purpose of ease gastrointestinal disorders by promoting gastric interstitial cells of Cajal vitality.

Yuanzhi；Houpo；processed products；gastric interstitial cells of Cajal; MTT

R 285.5

A

1674-926X(2014)02-018-03

成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

唐丹霞（1987-），硕士研究生，主要从事中药理论与应用研究 Email:tom_779@163.com

王建，教授，博士生导师，主要从事中药理论与应用研究 Email:jianwang08@163.com

2013-08-14