猪去氧胆酸与BSA相互作用研究

仇丽颖, 严平, 沈安静, 刘晖

（西南民族大学化学与环境保护工程学院, 四川 成都 610041）

猪去氧胆酸与BSA相互作用研究

仇丽颖, 严平, 沈安静, 刘晖

（西南民族大学化学与环境保护工程学院, 四川 成都 610041）

目的: 采用荧光光谱法研究猪去氧胆酸(HDCA)与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用. 方法: 根据25℃及37℃温度下HDCA对BSA的荧光猝灭作用, 通过Stern-volmer方程和Lineweaver-Burk双倒数方程计算反应的猝灭常数和形成常数以判断荧光猝灭类型, 采用双对数方程计算HDCA与BSA的结合常数(KA)和结合位点数(n), 最后采用热力学公式计算反应前后焓变和熵变确定两者结合的主要作用力类型. 结果: HDCA对BSA的荧光淬灭作用属于静态荧光淬灭. 在温度25℃和37℃时, HDCA与BSA的结合常数分别为0.258×106L·mol-1和0.453×104L·mol-1, 结合位点数分别0.92和0.62. 由于热力学参数焓变(ΔH=-258.72 KJ·mol-1)和熵变(ΔS=-0.76 J·mol-1·K-1)均小于零, 因此确定HDCA与BSA之间的作用力主要为氢键和范德华力作用. 结论: HDCA与BSA通过氢键和范德华力形成复合物, 经静态猝灭机制引起BSA内源性荧光猝灭.

猪去氧胆酸; 牛血清白蛋白; 荧光光谱

猪去氧胆酸(Hyodesoxycholic Acid, HDCA, 3α, 6α-二羟基-5β-胆烷酸)是从猪胆汁中提取的一种胆烷酸, 具有降血脂、镇痉、抑菌等作用[1], 是很多中成药如清开灵系列产品、胆酸止咳片、胆黄片、霍胆丸、胆香鼻炎片的主要有效成分, 因此被作为含量测定的检测对象, 以控制药品的质量. 然而, 药品疗效不仅与其外在质量息息相关, 更取决于药物或其活性代谢物在体内的存在状态和浓度, 因此药动学研究有助于对药物疗效或毒性做出正确评价, 也是制定安全有效给药方案的基础. 国内有关猪去氧胆酸的药动学研究极少, 仅见于清开灵注射剂的研究[2-3].

白蛋白是血浆中含量最高的载体蛋白, 主要与有机酸药物结合. 药物进入体循环后与白蛋白结合, 将不能跨膜转运, 储存于血浆中, 暂时失去药理作用. 因此, 药物与血浆蛋白结合能力的高低直接影响药物的临床疗效,是药动学研究的一个重要方面. 但猪去氧胆酸是否能与白蛋白相互作用的研究尚未见报道.

为阐明猪去氧胆酸与白蛋白相互作用的特征, 本研究采用荧光光谱法探索猪去氧胆酸与牛血清白蛋白(BSA)荧光猝灭类型, 计算出两者结合参数, 确定了两者结合的主要作用力类型. 研究结果可为探讨猪去氧胆酸在体内的转运、分配和代谢过程以及临床应用提供基础实验数据与理论依据.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CARY Eclipse荧光分光光度计(美国, Varian公司), PHS-3D型PH计( 上海智光仪器仪表有限公司 ), HH-2数显恒温水浴锅(国华电器有限公司). 牛血清白蛋白(Roche, 含量98%), 猪去氧胆酸(四川正东制药有限责任公司,含量95%), 三羟甲基氨基甲烷(Tris)(Bio-Rad, 含量99.9%). 除Tris为生化试剂外, 其余试剂均为分析纯, 实验用水为二次去离子水.

1.2 试验方法

1.2.1 溶液配制

三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲溶液: 精密称取NaCl及Tris 适量, 用去离子水配制成NaCl及Tris 浓度均为0.1 mol·L-1的溶液, HCl调节pH 7.4. 牛血清白蛋白(BSA)溶液: 精密称取BSA适量, 用Tris缓冲溶液配成4.0×10-5mol·L-1储备溶液. 猪去氧胆酸(HDCA)溶液: 精密称取猪去氧胆酸适量, 用甲醇溶解配制成浓度为5.0×10-4mol·L-1的工作溶液.

1.2.2 荧光光谱法

系列容量瓶中各精密加入l mL 4.0×l0-5mol·L-1的BSA溶液, 依次加入0, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600 μL的5.0×10-4mol·L-1猪去氧胆酸工作溶液, 再加入0.1 mol·L-1Tris缓冲溶液定容至10 mL, 摇匀, 水浴(25℃或37℃)孵育20min, 测定荧光光谱. 固定激发波长为278nm, 测定290～500nm范围内的荧光光谱. 仪器测定温度为25℃或37℃.

2 结果与讨论

2.1 HDCA与BSA相互作用的荧光光谱变化

在激发波长为278nm时, BSA结构中的色氨酸残基, 使其具有内源性荧光, 发射波长在327nm左右(图1A),而HDCA在此激发波长下荧光强度极弱(图2B). 向一系列等量BSA溶液中分别加入不同量的HDCA溶液, 随着加入量的增加(HDCA终浓度为0, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0×l0-7mol·L-1), BSA的内源荧光逐渐降低(图2), 最大发射峰的峰位略微发生蓝移. HDCA使BSA发生荧光猝灭, 并呈现剂量依赖性, 说明两者间产生了相互作用, 光谱的蓝移现象可能是BSA结构中的色氨酸的微环境发生了变化, 使其疏水性增强的结果[4-5].

图1. BSA(A)和HDCA(B)的激发光谱及荧光光谱 a. 荧光波长=327nm时的激发光谱; b. 激发波长=278nm时的荧光光谱Fig.1 The excitation spectra and fluorescence spectra of the BSA (A) and HDCA (B). a. The excitation spectra at 327nm fluorescence ; b. The fluorescence emission spectra at 278nm excitation

2.2 HDCA对BSA的荧光猝灭类型

生物大分子的荧光猝灭可分为动态猝灭和静态猝灭 . 动态猝灭是由于荧光分子和猝灭剂之间的分子扩散和碰撞引起的荧光强度减弱; 而静态猝灭是由于两者生成复合物而导致的荧光强度降低[6].

本文测定了常温下(25℃)和正常生理温度下(37℃), HDCA对BSA的荧光猝灭情况. 动态猝灭遵循Stem-volmer方程[7～9]:

F0和F分别表示猝灭剂(本文即HDCA浓度)不存在和存在时BSA的荧光强度, [Q]是HDCA浓度, Kq为双分子表观动态猝灭速率常数, Ksv为动态猝灭常数, τo为猝灭剂不存在时生物大分子的平均荧光寿命(约为10-8s[7,9]). 将(F0/F-1)对[Q]作图并进行线性拟合(见图3), 由直线的斜率可以求算出KSV, 进一步求算出Kq(见表1):

计算结果显示, 两个温度下HDCA对BSA的猝灭过程速率常数Kq远大于猝灭剂对生物大分子的最大碰撞猝灭速率常数2.0×1010mol-1·L·s-1[7,9], 说明HDCA对BSA的荧光猝灭不是动态猝灭, 而是静态猝灭.

静态猝灭可用Lineweaver-Burk双倒数方程[7,10]进行描述:

F0、F 和[Q]意义同前, KLB为静态猝灭过程中复合物的形成常数. 应用( F0- F)-1对[Q]-1作图, 进行曲线拟合可得到一条直线(见图4), 由直线的斜率和截距求算KLB(表1).

图2 不同浓度HDCA对BSA的荧光猝灭光谱 A. 25℃; B. 37℃Fig.2 quenching fluorescence spectra of BSA by HDCA A. 25℃; B. 37℃(CBSA: 4.0×l0-6mol·L-1; CHDCAfrom 1 to 9: 0, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0×l0-7mol·L-1)

表1 不同温度条件下HDCA与BSA猝灭反应参数Tab.1 quenching parameters of BSA reaction with HDCA at different temperatures

图3. 不同温度条件下HDCA对BSA荧光猝灭Stern-Volmer方程曲线Fig.3 Stern-Volmer piots of BSA fluorescence quenched by HDCA at different temperatures

图4. 不同温度条件下HDCA对BSA荧光猝灭Lineweaver-Burk方程曲线Fig.4 Lineweaver-Burk piots of BSA with HDCA at different temperatures

2.3 HDCA与BSA的结合常数和结合位点数

静态猝灭过程中的蛋白质与药物的结合常数(KA)和结合位点数(n)可利用方程(3)计算[7,11]:

以lg(F0/F-1)对lg[Q]作图后通过线性拟合可得到一条直线(见图5), 根据直线的截距和斜率求得HDCA与BSA的KA和n, 结果见表1.

2.4 HDCA与BSA结合反应的热力学性质及作用力类型

有机小分子和蛋白质生物大分子之间的结合力主要有疏水作用、力静电作用力、范德华力、氢键作用等. 由以下热力学参数关系式:

可以计算出HDCA与 BSA 相互作用的热力学函数值, 结果见表2.

图5. 不同温度条件下HDCA对BSA荧光猝灭的双倒数方程曲线Fig.5 Double logarithmic plots of BSA fluorescence quenched by HDCA at different temperatures

表2 不同温度条件下热力学参数Tab.2 The thermodynamic parameters at different temperatures

文献报道[6,12]判断生物大分子与有机小分子的结合性质有一定的热力学规律, 若ΔH>0, ΔS>0, 则表现为疏水作用力; 若ΔH<0, ΔS>0, 则表现为静电作用力; 若ΔH<0, ΔS<0, 则表现为氢键和范德华力. 由表2结果可知, ΔH<0, ΔS<0, 表明HDCA与BSA之间的作用力主要为氢键和范德华力.

3 结论

本文采用荧光光谱法研究了猪去氧胆酸与牛血清白蛋白的相互作用关系. 结果表明, 猪去氧胆酸对牛血清白蛋白具有较强的荧光猝灭作用, 属于静态猝灭类型, 两者之间主要以氢键和范德华力形成复合物, 因此猪去氧胆酸可被白蛋白贮存、运载. 当血浆蛋白含量受到一些生理、病理因素影响时, 血中游离猪去氧胆酸的浓度变化很大, 将直接影响药理作用强度, 此时应合理调整用药剂量.

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Study on interaction between hyodesoxycholic acid and bovine serum albumin

QIU Li-ying, YAN Ping, SHEN An-jing, LIU Hui,
(School of Chemistry and Environment Protection Engineering, Southwest University of Nationality, Chengdu 610041, P.R.C.)

Objective:To study the mechanism of interaction of Hyodesoxycholic acid (HDCA) and bovine serum albumin (BSA) by fluorescence spectroscopy.Method:At 25℃ and 37℃, quenching mechanism of the fluorescence of BSA was studied. Stern-volmer equation and Lineweaver-Burk double reciprocal equation were applied to determine the dynamic and static quenching constants. Double logarithmic equation was used to calculate the binding constants (KA) and the number of binding site (n). Thermodynamic equation was used to discuss the main binding force.Results:fluorescence quenching of BAS by HDCA belongs to static quenching type. At 25 ℃ and 37 ℃, the binding constants (KA) between HDCA and BSA were 0.258×106L·mol-1and 0.453×104L·mol-1, and the binding sites number (n) were 0.92 and 0.62, respectively. According to the thermodynamic parameters, enthalpy change (ΔH=-258.72 KJ·mol-1) and entropy change (ΔS=-0.76 J·mol-1·K-1), the interaction between HDCA and BSA was driven mainly by hydrogen bond and Van der Waals’ force.Conclusion:HDCA quenches the intrinsic fluorescence of BSA via static quenching mechanism, and the binding is mainly driven by hydrogen bond and Van der Waals’ force.

hyodesoxycholic acid; bovine serum albumin; fluorescence spectrometry; interaction

R917

A

1003-4271(2014)04-0504-05

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.04.06

2014-05-21

仇丽颖(1980-), 女, 汉族, 沈阳人, 讲师, 博士, 研究方向: 生物药物分析. E-mail: qiu7992@sina.com.